[发明专利]一种基于转录组学结合蛋白组学TMT研究莲花斑形成分析方法

权利要求书

1.一种基于转录组学结合蛋白组学TMT研究莲花斑形成分析方法，其特征在于，所述方法包括以下：

(1)转录组Illumina HiSeq测序：提取莲“大洒锦”花瓣总RNA，进行Total RNA样品检测，构建全转录组文库，文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段长度进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，库检合格后，进行HiSeq测序；

(2)蛋白组学TMT分析：采用酚抽提法提取蛋白，测定样品浓度，通过SDS-PAGE电泳检测样品，蛋白还原烷基化及酶解，进行TMT试剂蛋白标记及质谱检测，随后2D-LC-MSMS分析，完成样品中蛋白定性和定量；

(3)生物信息学分析：分别对转录组测序和蛋白组学TMT数据进行数据分析，以及关联分析，筛选莲“大洒锦”花斑形成的相关关键的调控蛋白和对应的基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中莲“大洒锦”花瓣总RNA采用Magen试剂盒RNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中构建全转录组文库方法包括以下步骤：

(1.1)样品检测合格后，用带有Oligo(dT)的磁珠，通过A-T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式富集真核生物的mRNA；

(1.2)加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA，然后合成二链cDNA，随后纯化双链cDNA；

(1.3)纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XPbeads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到cDNA文库。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)蛋白定性和定量分析为：对每组三个重复比较值数据进行t-test检验，计算每一比较组的差异倍数FC和差异显著性p-value，然后采取2倍差异倍数、p-value小于0.05的双标准筛选差异蛋白；倍数变化大于2或小于0.5并且p-value小于0.05认为是差异显著蛋白。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)转录组学数据分析包括基本分析、基因表达水平分析、差异表达分析、差异基因GO富集分析、差异基因KEGG富集分析；蛋白组学TMT数据分析包括GO功能分析、KEGGPathway分析、蛋白相互作用分析。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)转录组学数据分析得到的差异基因见表1：

表1差异基因

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7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)蛋白组学TMT数据分析得到的关键蛋白见表2：

表2 9个差异蛋白表达水平

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8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)关联分析得到与莲“大洒锦”红斑的形成有关的4个差异蛋白以及对应的基因，见表3：

表3 4个差异蛋白表达水平及对应基因

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