[发明专利]一种基于转录组学结合蛋白组学TMT研究莲花斑形成分析方法

说明书

本发明涉及一种基于转录组学结合蛋白组学TMT研究莲花斑形成分析方法，提供了揭示植物花斑形成的分子机理的一种新方法。收集莲“大洒锦”花瓣的样品，经过转录组Illumina HiSeq测序，筛选花青素代谢通路上表达差异基因，同时提取样品中的蛋白，测定蛋白质的浓度，质量检测，通过TMT标签标记，2D‑LC‑MS分析，结合蛋白组学进行生物信息学分析，筛选到调控花青素代谢通路上表达水平差异的蛋白，将转录组中的差异的基因关联到蛋白组中，筛选到调控莲“大洒锦”花斑的关键蛋白以及对应的基因，从而达到了解这些蛋白质和基因是如何调节莲“大洒锦”花斑的形成，为其它植物花斑形成的机理提供新思路新方法。

技术领域

本发明涉及水电工程新技术应用领域，尤其是一种基于转录组学结合蛋白组学TMT研究莲花斑形成分析方法。

背景技术

莲(Nelumbo nucifera)属于莲科(Nelumbonaceae)莲属(Nelumbo)，作为一种古老的多年生水生草本花卉，观赏价值很高，其中花色是其重要的观赏元素之一，并决定着莲的观赏价值。但关于莲花花斑形成机理的研究甚少，因此采用组学方法来研究莲的花斑形成机理势在必行，为研究植物花斑形成的机理开辟新的研究途径，随着人类基因组计划的完成以及科学技术的不断发展，仅依靠基因组、转录组的角度并不能全面、有效、准确地研究植物花斑形成生理代谢，结合蛋白组学研究可以达到科学准确研究。目前针对植物花斑研究采用的方法主要是转录组技术，筛选到表达差异的基因，这些基因与花斑的形成有关系，少有结合蛋白组学技术来研究植物花斑的形成。

尽管转录学已经发展成熟，但转录组仅研究细胞中基因的转录物(RNA)。一般植物的生理生化过程都受到蛋白-底物或蛋白-蛋白作用进行调控。转录组表达翻译产生蛋白，同时转录组受蛋白质等反馈调控。转录组和蛋白组对生理生化过程如何发挥作用，需要通过对基因表达和蛋白水平共同检测。目前联合蛋白组和转录组学技术发明的专利仅在肝癌生物学中(专利号：CN107918724A)。蛋白组学多用于医学研究，用于植物花斑形成研究方面经检索国内同行业未见相同蛋白组发明专利未报道。

发明内容

鉴于上述现有生产技术的不足，本发明的目的在于一种基于转录组学结合蛋白组学TMT研究莲花斑形成分析方法。

本发明采用以下技术方案：

一种基于转录组学结合蛋白组学TMT研究莲花斑形成分析方法，所述方法包括以下：

(1)转录组Illumina HiSeq测序：提取莲“大洒锦”花瓣总RNA，进行Total RNA样品检测，构建全转录组文库，文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段长度(insert size)进行检测，insertsize符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2nM)，以保证文库质量；库检合格后，进行HiSeq测序；

(2)蛋白组学TMT分析：采用酚抽提法提取蛋白，测定样品浓度，通过SDS-PAGE电泳检测样品，蛋白还原烷基化及酶解，进行TMT试剂蛋白标记及质谱检测，随后2D-LC-MSMS分析，完成样品中蛋白定性和定量；

(3)生物信息学分析：分别对转录组测序和蛋白组学TMT数据进行数据分析，以及关联分析，寻找样品中转录和蛋白表达均显示差异的分子进行注释、表达量分析和差异表达分析、差异表达聚类分析、差异表达基因的功能注释分析或其它数据挖掘工作，筛选莲“大洒锦”花斑形成的相关关键的调控蛋白和对应的基因，花斑的形成与花青素合成有直接的关系，因此主要集中研究其花青素代谢通路，这样可以找到目的基因及其蛋白。

优选地，所述步骤(1)中莲“大洒锦”花瓣总RNA采用Magen试剂盒

RNA。优选地，所述步骤(1)中构建全转录组文库方法包括以下步骤：