[发明专利]一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法

权利要求书

1.一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)设计靶向猪流行性腹泻病毒(PEDV)AJ1102株ORF3基因的两个sgRNA，利用CRISPR/Cas9系统体外切割含有PEDV AJ1102株全长cDNA的BAC质粒pBAC-AJ1102；

(2)利用融合PCR扩增含有猪流行性腹泻病毒AJ1102株ORF3基因上游序列、EGFP基因和PEDV AJ1102株ORF3基因下游序列的片段，该片段与切割后的pBAC-AJ1102上、下游各含有20bp的同源臂；

(3)用融合克隆重组酶将切割后的质粒pBAC-AJ1102与融合PCR产物以摩尔比为1:5的比例进行同源重组；

(4)将重组产物转化至DH10B化学感受态细胞中，利用PCR筛选阳性克隆，并对PCR产物进行测序；

(5)将测序正确的阳性克隆扩大培养后大量提取质粒；

(6)将提取的质粒用Lipofectamine 3000转染至Vero细胞，转染6h后，换上含有10μg/mL胰酶的无血清DMEM培养基，逐日观察细胞病变，

其中步骤(2)中所述的ORF3基因上游序列，EGFP基因和ORF3基因下游序列的核苷酸序列分别如下所示：

ORF3基因上游序列：

AGAGGCTATTAGTCAAACTTCTAAGGGTTTGAACACTGTGGCTCATGCGCTTACCAAGGTCCAAGAGGTTGTTAATTCGCAGGGTGCAGCTTTGACCCAACTTACCGTACAGCTGCAACACAACTTCCAAGCCATTTCTAGTTCTATTGATGACATTTACTCCCGACTTGACATTCTTTCAGCCGATGTTCAGGTAGACCGTCTCATCACCGGCAGATTATCAGCACTTAATGCTTTTGTTGCTCAAACCCTTACTAAGTATACTGAGGTTCAGGCTAGCAGGAAACTAGCACAGCAAAAGGTTAATGAGTGCGTTAAATCGCAATCTCAGCGTTATGGTTTTTGTGGTGGTGATGGCGAGCACATTTTCTCTCTGGTACAGGCCGCACCTCAAGGCCTGCTGTTTTTACACACAGTACTTGTACCGGGTGACTTTGTAAATGTTATTGCCATCGCTGGCTTATGTGTTAACGATGAAATTGCCTTGACTCTACGTGAGCCTGGTTTAGTCTTGTTTACGCATGAACTTCAAGATACTGCGACGGAATATTTTGTTTCATCGCGACGTATGTATGAACCTAGAAAACCTACCGTTGGTGATTTTGTTCAAATTGAGAGTTGTGTGGTCACCTATGGCAATTTGACTAGAGACCAACTACCAGAAGTAATCCCAGATTACATCGATGTTAACCAAACACTTGATGAGATTTTAGCTTCTCTGCCCAATAGAACTGGTCCAAGTCTTTCTCTAGATGTTTTTAATGCCACTTATCTTAATCTTACTGGTGAAATTGCAGATTTAGAGCAGCGTTCAGAGTCTCTCCGTAATACTACAGAAGAGCTTCAAAGTCTTATATATAATATCAACAACACACTAGTTGACCTTGAGTGGCTCAACCGAGTTGAGACATATATCAAGTGGCCGTGGTGGGTTTGGTTGATTATTTTTATTGTTCTCATCTTTGTTGTGTCATTACTAGTGTTCTGCTGCATTTCCACGGGTTGTTGTGGATGCTGCGGCTGCTGTGGTGCTTGTTTTTCAGGTTGTTGTAGGGGTCCTAGACTTCAACCTTACGAAGCTTTTGAAAAGGTCCACGTGCAGTG；

EGFP基因：

GAAAAGGTCCACGTGCAGTGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA；

ORF3基因下游序列：

TGGACGAGCTGTACAAGTAAGATTCAATTCAACTAGACGAGTATGCTACAATTAGTGAATGATAATGGTCTAGTAGTTAATGTTATACTTTGGCTTTTCGTACTCTTTTTCCTGCTTATTATAAGCATTACTTTCGTCCAATTGGTTAATCTGTGCTTCACTTGTCACCGGTTGTGTAATAGCGCAGTTTACACACCTATAGGGCGTTTGTATAGAGTTTATAAGTTTTACATGCAAATTGACCCCCTCCCCAGTACTGTTATTGACGTATAAACGAAATATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTGATGAGGTGATTGAACACCTTAGAAACTGGAATTTCACATGGAATATCATACTGACGATACTACTTGTAGTGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTGCGTTCTTGTATGGTGTCAAGATGGCTATTCTATGGATACTTTGGCCTCTTGTGCTGGCACTTTCACTTTTTGATGCATGGGCTAGCTTTCAGGTCAACTGGGTCTTTTTTGCTTT。