[发明专利]一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法

说明书

本发明属于动物传染病防制技术领域。具体涉及一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法。利用CRISPR/Cas9系统对含有PEDV AJ1102株全长cDNA的BAC质粒进行切割，再通过同源重组方式获得EGFP基因替换PEDV AJ1102株ORF3基因的重组BAC质粒，转染细胞后拯救出重组病毒rAJ1102‑△ORF3‑EGFP。由于不同的猪肠道冠状病毒具有相似的基因组结构与复制策略，本发明也适合于其它猪肠道冠状病毒重组病毒的构建。与传统方法相比，本发明具有靶点选择宽泛，特异性强，操作简单，效率高和实验周期短等突出优点，在一周之内便可获得重组病毒，是一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法。

技术领域

本发明属于动物传染病防制技术领域。具体涉及一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法。

背景技术

冠状病毒为单股正链RNA病毒，主要引起肠道和呼吸道感染，其中引起猪肠道感染的冠状病毒主要有猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,简称PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,简称TGEV)、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,简称PDCoV)和猪肠道α冠状病毒(porcine entericalphacoronavirus,简称PEAV)，这四种冠状病毒均能引起仔猪严重的腹泻，严重威胁着养猪业的健康发展。

冠状病毒重组病毒的构建往往是在获得病毒的感染性克隆/反向遗传操作系统的基础上，通过对靶基因进行改造或插入外源基因后实现的。当前构建猪肠道冠状病毒反向遗传系统的方法主要有四种：1)靶向RNA重组技术构建病毒的反向遗传操作系统(Li C,etal.Manipulation of the porcine epidemic diarrhea virus genome using targetedRNA recombination.PLoS One.2013,8(8):e69997.)。该操作可实现冠状病毒3’端结构基因的自由改造，但无法对冠状病毒5’端前2/3的复制酶基因区域的改造。2)利用细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)系统，将病毒全长基因组克隆至BAC载体中构建反向遗传操作系统(Gonzalez J,et al.Stabilization of a full-lengthinfectious cDNA clone of transmissible gastroenteritis coronavirus byinsertion of an intron.Journal of Virology.2002,76(9),4655-61；Almazan F,etal.Engineering infectious cDNAs of coronavirus as bacterial artificialchromosomes.Methods Mol Biol.2015,1282:135-152；Li J,et al.Development of thefull-length cDNA clones of two porcine epidemic diarrhea disease virusisolates with different virulence.PLoS One.2017,12(3):e0173998.)。该方法不涉及到体外连接和转录，且重组病毒的拯救效率高。3)利用体外cDNA连接的方法构建病毒的反向遗传操作系统(Yount,B,et al.Strategy for systematic assembly of large RNAand DNA genomes:transmissible gastroenteritis virus model.Journal ofVirology.2000,74(22):10600-11；Beall A,et al.Characterization of a pathogenicfull-Length cDNA clone and transmission model for porcine epidemic diarrheavirus strain PC22A.MBio.2016,7(1):e01451-15.)。该方法可利用II型限制性内切酶将病毒的多个cDNA片段一次性连接起来，再利用T7RNA聚合酶体外转录获得全长RNA，电转至敏感细胞系，拯救出重组病毒。用该方法进行病毒拯救通常需要同时电转相应病毒的N基因转录本以提高其拯救效率，同时，T7RNA聚合酶在工作时可能会产生突变，这在一定程度上影响了该方法的拯救效率。4)利用痘苗病毒作为载体构建病毒的感染性克隆(Thiel V andSiddell SG.Reverse genetics of coronaviruses using vaccinia virusvectors.Curr Top Microbiol Immunol.2005,287:199-227；van den Worm SH,etal.Reverse genetics of SARS-related coronavirus using vaccinia virus-basedrecombination.PLoS One.2012,7(3):e32857)。痘病毒载体携带的是T7RNA聚合酶系统，可以通过体外转录RNA再转染的方式拯救病毒，也可以直接转染表达T7RNA聚合酶的细胞系来完成拯救。转染前细胞需要先感染禽痘病毒辅助病毒，以提供痘病毒载体起始转录必要的组分(Casais et al.,Modular organization of SARS coronavirus nucleocapsidprotein.Journal of Biomedical Science.2001,13:59-72)。