[发明专利]用于治疗受精障碍致女性原发不孕症的制剂及其使用方法

权利要求书

1.一种用于治疗受精障碍致女性原发不孕症的制剂，其特征在于，该制剂由一定浓度WEE2 cRNA或WEE2蛋白质配制而成，所述WEE2基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述的WEE2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；WEE2 cRNA的浓度为300-1000ng/ul；WEE2蛋白质的浓度为0.5-1mg/ml。

2.一种如权利要求1所述制剂的使用方法，其特征在于，具体步骤为：

（1） 取出患者卵子，将颗粒细胞消化掉，选择MII期卵子，首先进行WEE2 cRNA制剂或WEE2蛋白质制剂注射，注射浓度：WEE2 cRNA为300-1000ng/ul，WEE2蛋白质制剂为0.5-1mg/ml，注射体积为5-15pL，4-5小时后再进行卵浆内单精子注射（ICSI），15-18h后观察雌雄原核形成；

（2）形成原核的受精卵培养观察到第5-6天，将发育正常的囊胚活检同时冻存，染色体正常的囊胚将用于将来移植。

3.一种用于受精障碍致女性原发不孕患者的基因治疗方法，其特征在于，具体步骤为：

（1）WEE2 cRNA制剂和WEE2蛋白质制剂的制备

（a）WEE2 cRNA制剂制备：以WEE2基因cDNA为模板通过PCR扩增WEE2的编码区（含终止密码子），纯化PCR产物并以此为模板经过SfaAI 和MluI双酶切后构入载体pCMV6，用AgeI将载体单酶切，体外转录成WEE2的cRNA，并将其浓度稀释到300-1000ng/ul；

（b）WEE2蛋白质制剂制备：以WEE2基因cDNA为模板通过PCR扩增WEE2的编码区（含终止密码子），纯化PCR产物并以此为模板经过BamHI 和XhoI双酶切后构入载体pFast-Bac1，转化DH10Bac E.coli，通过蓝白斑筛选挑出阳性克隆并测序验证；Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞，获得P1代和P2代病毒；P2代病毒继续感染Sf9细胞，感染48-72小时收集细胞；超声破碎，超速离心取上清；经纯化后获得目的蛋白，调整浓度为0.5-1mg/ml；

（2）取出患者卵子，将颗粒细胞消化掉，选择MII期卵子，首先进行WEE2 cRNA制剂或WEE2蛋白质制剂注射，注射浓度：WEE2 cRNA为300-1000ng/ul，WEE2蛋白质制剂为0.5-1mg/ml，注射体积为5-15pL，4-5小时后再进行卵浆内单精子注射（ICSI），15-18h后观察雌雄原核形成；

（3）形成原核的受精卵培养观察到第5-6天，将发育正常的囊胚活检同时冻存，染色体正常的囊胚将用于将来移植。