[发明专利]一种抑制性的合成Notch和双靶点系统及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种抑制性的合成Notch和双靶点系统及其制备方法和应用，其包含有Notch1序列与CSK激酶结合的融合蛋白。利用抑制性的合成Notch得到双靶点系统可以同时靶向两种肿瘤相关抗原，提高T细胞杀伤肿瘤细胞的准确性，有效克服靶向单一肿瘤相关抗原所导致的脱靶毒性。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种抑制性的合成Notch和双靶点系统及其制备方法和应用。

背景技术

近几年，肿瘤免疫疗法发展迅速，成为继手术、化疗和放疗之后的第四种治疗手段。肿瘤免疫疗法通过激活或增强人体免疫系统功能而达到杀伤肿瘤的目的，包括肿瘤疫苗、细胞因子、溶瘤病毒、免疫检查点抑制剂和过继免疫细胞治疗(adoptive celltherapy，ACT)等。免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体T细胞 (chimeric antigen receptorT cell，CAR-T)，在治疗肿瘤试验中取得重大进展，显示出根治肿瘤的潜力。2013年，《科学》杂志将肿瘤免疫疗法列为年度十大科学突破之首。2017年，美国FDA先后批准两款CD19CAR-T细胞上市，Novartis 的Kymriah治疗儿童和青少年难治/复发急B性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL))，以及Kite的Yescarta治疗成人复发性/难治性弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)，成为过继免疫细胞治疗肿瘤的里程碑事件。

经过多年的研究改进，CAR-T细胞已发展至第四代。嵌合抗原受体包括胞外单链可变片段(single-chain variable fragments，scFv)、铰链区(hinge，H)、跨膜区(transmembrane，TM)、胞内共刺激结构域(costimulatory molecule，CM) 和CD3ζ激活结构域。第一代CAR-T细胞内部只具有CD3ζ或FcRγ的激活结构域，增殖能力不足，抗肿瘤效果差。在第一代CAR基础上，增加一个或两个共刺激结构域，如CD28、4-1BB和OX40等，为第二代或第三代CAR-T细胞，大幅提高CAR-T细胞分泌的细胞因子水平和杀伤效果。第四代CAR-T细胞，又称通用细胞因子杀伤的重定向T细胞(T cells redirected for universalcytokine killing， TRUCK)，在第二代或第三代CAR-T细胞基础上，表达IL-12等促炎细胞因子或4-1BBL、CD40L等共刺激配体，解除免疫抑制，募集其它免疫细胞迁移到肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)，引发广泛的抗肿瘤反应，且杀伤抗原阴性的肿瘤细胞。

迄今为止，CAR-T细胞的临床试验及研究进展主要集中在白血病和淋巴瘤等液体肿瘤领域。CD19 CAR-T细胞获得FDA批准上市，标志CAR-T细胞由临床研究向临床应用转化。然而，CAR-T细胞治疗实体瘤的临床研究进展迟缓，主要原因有实体瘤复杂的异质性、组织隔离屏障、免疫抑制和脱靶毒性(on target/off tumor)等。其中，脱靶毒性问题是一个不可回避的重大挑战。

根据表达组织的专一性程度，肿瘤抗原分为肿瘤特异性抗原(tumor specificantigen，TSA)和肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)。TSA是指肿瘤细胞所特有的抗原，不表达于任何正常细胞和组织中，如突变蛋白和肿瘤新抗原。TAA是指肿瘤细胞高表达，而正常细胞低表达的抗原。目前，CAR-T细胞识别的肿瘤抗原，特别是实体瘤抗原，只有少数是TSA，绝大部分是TAA，因此普遍存在脱靶毒性问题。CAR-T细胞治疗实体瘤的脱靶毒性的严重程度可危及患者生命。在一项HER2 CAR-T细胞治疗直肠癌合并肝肺转移的试验中，患者发生急性肺水肿，最终死于呼吸衰竭，主要原因是肺血管等组织低表达HER2，引发HER2 CAR-T细胞攻击肺组织。CAIX CAR-T细胞治疗转移性肾细胞癌，患者发生严重的黄疸和胆管炎，因为胆管上皮细胞低表达CAIX，造成CAIX CAR-T 细胞浸润至胆管上皮组织。随着CAR-T细胞的发展和杀伤活性增强，其脱靶毒性更加受到关注。