[发明专利]检测志贺氏菌属的肽核酸原位荧光杂交鉴定方法及肽核酸探针在审
| 申请号： | 201910628531.8 | 申请日： | 2019-07-12 |
| 公开（公告）号： | CN110283920A | 公开（公告）日： | 2019-09-27 |
| 发明（设计）人： | 刘光富;俞晓平;张蓬军;申屠旭萍;郝培应 | 申请（专利权）人： | 中国计量大学 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12Q1/6841;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/01 |
| 代理公司： | 杭州求是专利事务所有限公司 33200 | 代理人： | 郑海峰 |
| 地址： | 310018 浙江省*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 志贺氏菌属 肽核酸 原位荧光杂交 检测 肽核酸探针 探针 荧光原位杂交 特异性结合 细胞穿透性 高稳定性 技术结合 志贺氏菌 快速性 准确率 灵敏 杂交 | ||
1.用于检测志贺氏菌属的肽核酸探针，其特征在于：所述肽核酸探针的DNA序列如SEQID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的肽核酸探针，其特征在于，其能检测志贺氏菌属(ShigellaCastellani)rRNA、rDNA或rRNA的序列互补中的靶序列。
3.根据权利要求1或2所述的肽核酸，其特征在于，其N端被连接于至少一种类型的标记物质。
4.根据权利要求3所述的肽核酸，其特征在于，N端标记物质选自下列之一：荧光素、生物素、地高辛。
5.用于检测志贺氏菌(Shigella Castellani)的方法，其特征在于，其使用权利要求1-4任一项所述的肽核酸探针，且其包括以下步骤：
(1)取1-5克待检样品，并将样品置于含有5-8ml灭菌LB培养液的试管中，37℃振荡培养1小时；
(2)离心收集菌体，用无菌水清洗一次，再用无菌水悬浮，制成菌悬液；
(3)取8-10μl步骤(2)的菌悬液点在消毒过的载玻片上，加入5-10μl固定液涂匀；
(4)将步骤(3)载玻片放入烘箱80℃烘烤20-30分钟；
(5)取15-20μl的含25ng/ml权利要求1-4任一项所述肽核酸探针的杂交液滴加到载玻片上，55℃杂交20-30分钟；
(6)杂交后用洗涤液洗涤2-3次，每次5分钟；
(7)风干后显微镜观察其荧光亮度及细菌形态。
6.根据权利要求5所述的检测志贺氏菌(Shigella Castellani)的方法，其特征在于，所述固定液包含0.04-0.06g/mL的多聚甲醛和0.08-0.1g/mL的氢氧化钠。
7.根据权利要求5所述的检测志贺氏菌(Shigella Castellani)的方法，其特征在于,所述杂交液包含体积百分数为2％-3％的甲酰胺，0.05-0.1g/mL的硫酸葡萄糖，10mM氯化钠，0.001-0.002g/mL聚蔗糖，5mM乙二胺四乙酸。
8.根据权利要求5所述的检测志贺氏菌(Shigella Castellani)的方法，其特征在于，所述洗涤液包含10mM马来酸，体积百分数为0.3-0.5％的吐温20。
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