[发明专利]检测志贺氏菌属的肽核酸原位荧光杂交鉴定方法及肽核酸探针

说明书

本发明公开了检测志贺氏菌属的肽核酸原位荧光杂交鉴定方法和肽核酸探针。涉及用于鉴定不同类型的样品中志贺氏菌属(Shigella Castellani)肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)探针的设计，该PNA探针的DNA序列如SEQ ID:1所示。将这些探针与荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术结合用于检测志贺氏菌。本发明的PNA具有与DNA和RNA特异性结合的高稳定性、杂交快速性及其良好的细胞穿透性，PNA与FISH技术的结合，使本发明的检测方法具有快速，准确和灵敏的特性，提高了鉴定的准确率。

技术领域

本发明涉及检测与食品安全性相关联的微生物的方法，尤其涉及一种检测志贺氏菌属的肽核酸原位荧光杂交鉴定方法及肽核酸探针

背景技术

食源性致病菌是引起食源性疾病的主要因素之一，在世界食品安全领域中备受关注。WHO报告表明，全球每年发生40～60亿例食源性疾病，其中约70％是因生物源性污染食品所致。发展中国家每年约有180万人口死于食源性疾病，即使是在发达国家，每年亦有10％以上的人群感染食源性疾病。目前世界公认的能引起食源性疾病的重要致病菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157、志贺氏菌等广泛存在于奶制品、蔬菜、水产品、肉制品等多种食物中，是引起食品污染的重要因素。因此，食源性致病菌的有效检测对于监控食品安全是非常重要的。

志贺氏菌属(Shigella Castellani)是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。志贺氏菌通过食品感染人类，在奶制品、水产品、鸡肉、水果、面包等食品中经常被检出。发病时若不及时救治，会危及生命。志贺氏菌自从被人们发现以来，其分离培养鉴定和常规鉴定技术已经相当成熟。然而，随着科学技术的发展，传统的细菌分离鉴定、培养及生化反应的鉴定已经远远不能够支撑对病原微生物的诊断和流行病学的研究，也远远不及现在的致病微生物检测速度快、方便、特异性高、敏感性高、低耗能。

志贺氏菌属(Shigella Castellani)的检测传统上使用培养方法进行。但是，这些方法费时费力，因此，许多分子检测方法被开发出来，包括聚合酶链式反应(PCR),基因芯片技术等。免疫学检验检验方法，如酶联免疫吸附法，SPA协同凝集法，蛋白质印迹法，环介导等温扩增技术(LAMP)等，相关的有关志贺氏菌的检测方法也报道了很多，如公开号为CN107904320A专利是利用环介导恒温扩增方法来检测志贺氏菌，但该方法需要提取待测菌的基因组DNA，且引物的设计复杂，导致该检测方法耗时。公开号为CN108660228A专利是利用荧光定量PCR技术来检测志贺氏菌，存在假阳性，且其公开的引物设计复杂。公开号为CN102424839A专利公布了多重PCR检测志贺氏菌的方法，该方法需要增菌8-24小时，且需要提取待测菌的DNA，耗时费力。公开号为CN108950037A专利公开了双重LAMP检测志贺氏菌的方法，方法繁琐，耗时。标准SN/T 2754.3-2011公布的检测方法为环介导恒温(LAMP)扩增检测方法，引物设计复杂，需要提取细菌基因组DNA，耗时。

肤核酸是年由丹麦科学家Nielsen等人设计的一种以中性酞胺键为骨架的全新的模拟物,其骨架结构单元为甘氨酸,碱基部分通过亚甲基羧基连接与主骨架的氨基N上,可以序列特异地与DNA、RNA结合。其骨架为电中性,与DNA-DNA或RNA-DNA互补链相比，PNA-DNA和PNA-RNA互补不存在静电排斥作用，,因此具有很高的DNA或RNA亲和性,在无错配的情况下其结合具有高稳定性,且杂交速度快,具有良好的细胞穿透性,是核酸探针的良好选择。同时PNA探针结合原位荧光杂交技术(FISH),与传统生化鉴定比较,PNA-FISH法可节约大量时间。基于荧光检测和形态检测的PNA-FISH结果判断方法，提高了检测的准确性，避免了假阴性，假阳性的出现。

发明内容

本发明的第一个目的是设计了用于检测主要食源性致病菌志贺氏菌属的肽核酸原位荧光鉴定用PNA探针，该探针具志贺氏菌特异性。