[发明专利]一种从核桃无融合生殖胚诱导体细胞胚的方法

权利要求书

1.一种从核桃无融合生殖胚诱导体细胞胚的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获得核桃无融合生殖的幼果，并对幼果进行消毒处理；

(2)从消毒处理后的幼果中剥取幼胚，分离幼胚的胚轴和子叶作为外植体；

(3)将外植体接种到初代培养基中进行培养，获得初生体细胞胚；

(4)将初生体细胞胚接入增殖培养基，进行继代培养，获得次生体细胞胚。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，核桃无融合生殖的幼果的获得方法为：于3月份对优良核桃品种进行套袋处理，7～9周后摘袋收集核桃幼果。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述消毒处理方法为：将采集的核桃幼果剪去果柄、花柱及柱头，用洗涤剂清洗幼果，75％的酒精表面消毒30s，用水冲洗干净；3％的次氯酸钠溶液表面消毒25min，无菌水冲洗4～5次。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，从消毒处理后的幼果中剥取幼胚的方法为：于无菌条件下用灭菌的吸水滤纸吸干幼果表面水分，用无菌解刨刀切除青皮和果壳，取出完整幼胚。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，外植体的接种方法为：在每个含有初代培养基的培养皿中接种4～8个外植体，接种完后用封口膜封口。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述初代培养基为添加有0.5～2.0mg·L^-1 6-BA、0.5～2.0mg·L^-1KT、0.1～0.01mg·L^-1IBA、20～30g·L^-1蔗糖和7～8g·L^-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述培养的条件为：在黑暗条件下进行培养，培养温度为21～23℃，每天转移一次至新鲜的初代培养基中，1周后每周转移1次。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，将长度为2～4mm的初生体细胞胚接入增殖培养基。

9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述增殖培养基为添加有20～30g·L^-1蔗糖和7～8g·L^-1琼脂的DKW培养基，pH值为5.6。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述继代培养的条件为：在黑暗条件下进行培养，培养温度为21～23℃，接种后每两周转接一次培养基。