[发明专利]一种从核桃无融合生殖胚诱导体细胞胚的方法

说明书

本发明公开了一种从核桃无融合生殖胚诱导体细胞胚的方法，包括以下步骤：(1)获得核桃无融合生殖的幼果，并对幼果进行消毒处理；(2)从消毒处理后的幼果中剥取幼胚，分离幼胚的胚轴和子叶作为外植体；(3)将外植体接种到初代培养基中进行培养，获得初生体细胞胚；(4)将初生体细胞胚接入增殖培养基，进行继代培养，获得次生体细胞胚。本发明有效解决了核桃体细胞胚诱导发生极为困难，体细胞胚继代增殖率低的问题。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种从核桃无融合生殖胚诱导体细胞胚的方法。

背景技术

核桃(Juglans regia L.)是人类最古老的食物之一，历史文献可以追溯到公元前7000年的波斯(Salas-Salvadóet al.，2011)。核桃栽培遍及世界六大洲的50个国家和地区，其中以亚洲、欧洲和美洲的核桃栽培面积最大，产量最高，其年产量约占世界总产量的98.76％(Bernard A et al.，2018；FAOSTAT，2017)。我国是世界核桃生产大国，2015年我国核桃产量33.32万t，为2014年产量27.14万t的122.8％，核桃产业发展迅速(张淑英，2016)。核桃仁具有重要的营养和医疗保健价值，据《本草纲目》记载，“核桃仁，通命门，利三焦，益气养血，令人肥健、能食、润肌、黑发、固精、治燥、调血之功。”2004年美国食品与药物监理局(FDA)通过了对核桃作为健康食品的准可，核桃对于心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、癌症和神经系统疾病有一定的康复治疗和预防效果，被称为“2l世纪的超级食品”(Bitok E et al.，2017；Ma Y et al.，2010；李敏等，2009)。核桃木质重而坚硬，耐冲撞耐磨擦耐腐朽，容易乾燥，少变形，是优质高档用材(郗荣庭，1996)。

历史上，由于核桃嫁接等无性繁殖难于成活，我国核桃一直采用实生繁殖，单株变异大，产量低、品质差，长期处于散生栽培状态(张美勇等，2000)。上个世纪90年代，利用夏季方块芽接技术提高了核桃嫁接成活率，解决了核桃嫁接繁殖瓶颈(李复温等，1996)，这极大推动了我国核桃良种化、商品化和产业化发展。

核桃具有无融合生殖(Apomixis)现象(高绍棠等，1999)，无融合生殖是指植物不经过精卵细胞融合而产生有生活力种子的一种特殊生殖方式，其中双倍无孢子生殖和不定胚生殖能使世代重迭而不改变核相,可获得遗传结构上与母本完全相同的子代，通过无融合生殖植株中可以繁殖大量的具有优良基因型的优良品种，从而大大扩展了遗传资源的多样性(Richard et al，1994)。核桃的体细胞胚具有完整的两极结构，具有发育成完整植株的能力(Tulecke et al，1999)，核桃体细胞胚能通过诱导增殖而形成体细胞胚无性系。将核桃无融合生殖的特性和体细胞胚诱导的技术结合不仅能加速核桃育种的速度，消除或减少通过繁殖传播的疾病，消除与有性生殖机制带来的作物损失，还能使优良核桃品种的产量大幅增加。

目前已经有多种植物已经报道了体细胞胚的发生，对于大规模克隆，胚胎发生可能比器官发生更好，因为它可以直接产生完整的植物，此外，体细胞胚也是转基因的更好的材料(Gill et al.，2018)。关于核桃体细胞胚的诱导方法，自1985年Tulecke和McGranahan首次报道核桃的体细胞胚胎发生以来，国内外在这方面进行的研究较少，核桃体细胞胚是1985年Tulecke首次从自然授粉的核桃品种中诱导发生的，在这之后在核桃五个种三个杂种当中有了体细胞胚发生的报道(汤浩茹，2000)。袁巧平等(1990)通过在改良的DKW培养基上接种核桃幼胚经过20d左右的黑暗培养形成了球形、心形、鱼雷形等不同发育时期的体胚，但是其产生畸形胚的概率较高；1992年刘淑兰等将胚状体结构从叶柄中诱导出来，但未能形成体细胞胚；2011年张启香等以山核桃子叶为外植体于DKW、MS、1/2MS、WPM培养基上均诱导出了体细胞胚，但是体细胞胚诱导率较低。以上研究说明核桃体细胞能诱导发生，但没有稳定的核桃体细胞胚诱导发生体系，以致出胚较难。因此，建立高效稳定的核桃体细胞胚发生体系，提高核桃体细胞胚发生率，提高核桃次生胚增殖率，已成为目前国内外核桃组培中的难点。