[发明专利]一种基于胶原蛋白的软骨再生载体的制备方法

说明书

本发明公开一种基于胶原蛋白的软骨再生载体的制备方法，包括牛跟腱洗净处理、酶解、离心取上清制备胶原粗提液；中性盐盐析离心获得胶原蛋白沉淀，并加入磷酸盐缓冲液获得胶原蛋白原液；在胶原蛋白原液中加入一定体积的酸，通过分散器分散2～10min；再次加入一定体积的酸，通过分散器分散1～10min，通过搅拌机搅拌10～180min，使用均质机、分散器或搅拌机使蛋白溶液均一后，将胶原蛋白溶液分装于离心杯中配平，1000～2500r/min离心5～35min。

技术领域

本发明涉及一种软骨再生载体的制备方法，尤其是一种基于胶原蛋白的软骨再生载体的制备方法。

背景技术

目前临床上已有多种材料和方案用于软骨损伤的修复，但都存在不同程度的应用缺陷，如微骨折术原型是软骨下骨钻孔术，简单有效，短期效果良好，但是新形成的修复组织不是真正的关节面软骨，更多是纤维软骨成分，时间久了会变硬失去软骨功能。如基质诱导的软骨细胞移植技术，作为临床上应用最为广泛的软骨组织工程技术，的确能为软骨修复提供良好的选择，但这项技术需要一期手术获取自体细胞，进行分离、培养及诱导分化，再进行二期手术移植，操作难度大，费时较长，费用较高。

而最新研究发现，胶原蛋白可以诱导人体干细胞生成新的软骨。植入人体后，胶原蛋白作为自体软骨细胞再生支架，植入部位周围结缔组织细胞，将生长进入胶原蛋白网状结构中，逐渐形成与正常组织类似的仿生结构，从而起到治疗作用。另胶原蛋白具有可吸收降解特性，可逐渐被体内蛋白酶分解，安全无毒。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于胶原蛋白的软骨再生载体的制备方法。采用无菌低热源的胶原蛋白原液，在局部百级环境下配制成可用于关节软骨损伤、创伤性或退行性关节软骨缺损修复等疾病的软骨再生载体。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：包括以下步骤：步骤一，胶原蛋白原液提取，步骤二，配制6～20mg/ml左右浓度的胶原蛋白溶液；步骤三，均质胶原蛋白溶液；步骤四，胶原蛋白溶液除泡。

作为对本发明所述的一种基于胶原蛋白的软骨再生载体的制备方法的改进：所述胶原蛋白原液的提取步骤如下：①牛跟腱解冻，去血水、表面异物和筋膜，用溶液进行一次预处理；②步骤一处理的牛跟腱去脂肪膜，用溶液进行二次预处理；③步骤二处理完的牛跟腱冷冻后切片，用溶液进行前处理；④将前处理完的牛跟腱切片持续酶解，离心取上清制备胶原粗提液；⑤调节胶原粗提液pH，加入中性盐盐析，离心获得胶原蛋白沉淀；⑥加入磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀，获得胶原蛋白原液。

作为对本发明所述的一种基于胶原蛋白的软骨再生载体的制备方法的进一步改进：所述浓度配制的步骤如下：称取一定质量的胶原蛋白原液，调整浓度后获得胶原蛋白溶液；搅拌胶原蛋白溶液至无颗粒,并调节pH至4.0～7.0之间。

作为对本发明所述的一种基于胶原蛋白的软骨再生载体的制备方法的进一步改进：所述胶原蛋白溶液的质量浓度为6～20mg/ml。

作为对本发明所述的一种基于胶原蛋白的软骨再生载体的制备方法的进一步改进：胶原蛋白溶液调整步骤如下：在胶原蛋白原液中加入一定体积的酸，通过分散器分散2～10min；再次加入一定体积的酸，通过分散器分散1～10min。

作为对本发明所述的一种基于胶原蛋白的软骨再生载体的制备方法的进一步改进：胶原蛋白溶液搅拌步骤如下：通过搅拌机搅拌10～180min。

作为对本发明所述的一种基于胶原蛋白的软骨再生载体的制备方法的进一步改进：调节胶原蛋白溶液pH步骤中，采用2％～20％氢氧化钠溶液、氢氧化钾或碳酸氢钠中的一种或几种。

作为对本发明所述的一种基于胶原蛋白的软骨再生载体的制备方法的进一步改进：所述酸为乙酸、柠檬酸、酒石酸或亚酒石酸。