[发明专利]一种猪源衍生杂合抗菌肽MDP-2及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种猪源衍生杂合抗菌肽MDP‑2及其制备方法和应用，其序列如序列表SEQ ID No.2所示。本发明根据抗菌肽PMAP‑23或PMAP‑36的氨基酸组成特点和分布，将天然抗菌肽进行截短和残基替换，得到猪源衍生肽；将衍生肽与髓样分化蛋白‑2的脂多糖绑定序列相互连接，以进一步增强衍生肽的细菌靶定能力，最后获得氨基酸长度从20至24不等的4条衍生杂合肽；然后合成多肽；进行纯化、鉴定；最后，通过最小抑菌浓度和溶血试验测定衍生抗菌肽的抑菌活性和细胞毒性，筛选具有较理想活性的多肽。本发明的有益效果：该多肽属于天然衍生物，安全性较好，具有广谱抗菌活性和低毒性；制备方法和技术成熟，合成成本低。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪源衍生杂合抗菌肽MDP-2及其制备方法和应用。

背景技术

自上个世纪抗生素发明以来，其在动物养殖生产中占据着重要的地位，为预防和治疗畜禽疾病、保证畜禽健康发挥重要的作用。但随着抗生素的不断应用，许多问题也逐渐显现；尤其是不规范使用和滥用导致超级细菌的出现，耐药性细菌使得畜牧产业陷入恐慌，同时停药期不当也使得畜产品品质下降、药物残留不达标，影响了消费者健康和食品安全。继上个世纪末瑞典等国家开始逐渐禁用某些抗生素，现在许多国家纷纷出台政策限制抗生素的饲用，这就为抗生素的替代提出了新的挑战和课题。人们纷纷寻找抗生素替代物，其中益生菌、中草药、抗菌肽等备受关注；其中抗菌肽是动物机体天然免疫的重要组成部分，天然无毒且拥有独特的不同于传统抗生素的物理破膜杀菌机制脱颖而出。天然抗菌肽具有疏水性和正净电荷的特点，氨基酸残基长度从十以下到几十不等。

猪源抗菌肽种类较多，其中髓源抗菌肽PMAP-23和PMAP-36研究较为广泛。但是，这两种抗菌肽的抗菌活性和细菌靶定能力还不强，且还具有一定的细胞毒性等问题，因此限制了它们在实际生产中的应用。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种猪源衍生杂合抗菌肽MDP-2，其序列如序列表SEQ ID No.2所示，该衍生杂合肽源自猪防御肽，属于天然抗菌肽的衍生物，安全性较好，具有广谱抗菌活性和低毒性。

本发明的另外一个目的在于提供一种猪源衍生杂合抗菌肽MDP-2的制备方法，制备方法和技术成熟，合成成本低，方法步骤如下：

(1)根据cathelicidin家族抗菌肽PMAP-23或PMAP-36的氨基酸组成特点和分布，将天然抗菌肽进行截短和残基替换，得到猪源衍生肽；将猪源衍生肽与髓样分化蛋白-2的脂多糖绑定序列FSKGKYKCV相互连接，以进一步增强猪源衍生肽的细菌靶定能力，最后获得氨基酸长度从20至24不等的4条猪源衍生杂合肽MDP-1，MDP-2，MDP-3和MDP-4，其序列分别如序列表SEQ ID No.1-4所示；

(2)采用固相化学合成法，通过多肽合成仪合成这几条多肽；

(3)将合成的多肽使用反相高效液相色谱进行纯化，并利用电喷射质谱法对合成的多肽进行鉴定，完成多肽的制备；

(4)采用美国临床实验室标准化研究所推荐的测定最小抑菌浓度的方法，发现猪源衍生杂合肽MDP-2的最小抑菌浓度平均达到4μM，相比于其它猪源衍生杂合肽的抑菌活性强，通过最小溶血浓度测定多肽的细胞毒性，发现4条多肽在256μM浓度均没有细胞毒性，猪源衍生杂合肽MDP-2的治疗指数最高达到了128，综合抑菌活性和溶血活性，从而选取猪源衍生杂合肽MDP-2。

本发明的另外一个目的在于提供如上所述的猪源衍生杂合抗菌肽MDP-2在制备治疗革兰氏阳性菌或/和革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。