[发明专利]同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)方法

权利要求书

1.同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，包括：

利用高效液相串联质谱仪，分别检测至少三种浓度混合标准溶液，其中，所述混合标准溶液为具有内标物的维生素K1和维生素K2(MK4)混合标准溶液，且所述至少三种浓度混合标准溶液中内标物浓度一致；

根据所述至少三种浓度混合标准溶液的检测结果，分别拟合维生素K1的标准曲线方程以及维生素K2(MK4)的标准曲线方程；

向固定量的具有已知浓度内标物的混合内标溶液中，顺序添加待检测样品离心后的第一上清液和沉淀蛋白试剂，混合，并添加萃取剂，混合，高速离心，取第二上清液，其中，所述第一上清液的添加量为50～300μL；

通过氮吹方式，吹干所述第二上清液，通过复溶液溶解吹干后的剩余物，混合，高速离心，取第三上清液；

利用高效液相串联质谱仪，检测所述第三上清液；

基于所述第三上清液的检测结果和维生素K1的标准曲线方程以及维生素K2(MK4)的标准曲线方程，得到所述待检测样品中维生素K1和维生素K2(MK4)的浓度。

2.根据权利要求1所述的同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，

所述高效液相串联质谱仪中，

高效液相色谱的色谱条件包括：

长度为50mm、内径为3.0mm以及填料粒径为2.7μm的C18色谱柱；

洗脱流动相为含0.05％-0.25％甲酸的甲醇以及含0.05％-0.25％甲酸的乙腈；

分析时长为4.0min；

柱温为25-35℃；

进样量为0.1-30μL；

流速为0.50-1.00mL/min。

3.根据权利要求1或2所述的同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，

所述高效液相串联质谱仪中，

串联质谱条件包括：

采用大气压化学电离源APCI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，气帘气压力为20psi；碰撞气为5L/min；温度为300℃；雾化气压力为25psi；放电电流为1mA。

4.根据权利要求1所述的同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，

所述具有已知浓度内标物的混合内标溶液的固定量为10μL；

和/或，

所述沉淀蛋白试剂为乙醇，所述乙醇的用量为100～500μL；

和/或，

所述萃取试剂为正己烷，所述正己烷的用量为800～1200μL；

和/或，

所述复溶液为乙腈，所述乙腈的用量为50～200μL。

5.根据权利要求2所述的同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，

所述高效液相色谱采用梯度洗脱。

6.根据权利要求5所述的同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，

所述梯度洗脱，包括：

0.0～1.5min，含0.05％-0.25％甲酸的甲醇与含0.05％-0.25％甲酸的乙腈的体积比为25：75；1.5～3.4min，含0.05％-0.25％甲酸的甲醇与含0.05％-0.25％甲酸的乙腈的体积比为100：0；3.4～3.5min，含0.05％-0.25％甲酸的甲醇与含0.05％-0.25％甲酸的乙腈的体积比为25：75。

7.根据权利要求1至6任一所述的同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，其特征在于，

所述维生素K1的标准曲线方程中的两个变量分别为：

维生素K1的色谱峰面积与对应内标物的色谱峰面积的比值以及维生素K1浓度与对应内标物浓度的比值；

所述维生素K2(MK4)的标准曲线方程中的两个变量分别为：

维生素K2(MK4)的色谱峰面积与对应内标物的色谱峰面积的比值以及维生素K2(MK4)浓度与对应内标物浓度的比值。