[发明专利]同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)方法

说明书

本发明提供了一种同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，该方法包括：利用高效液相串联质谱仪，分别检测至少三种浓度具有内标物的维生素K1和维生素K2(MK4)混合标准溶液，拟合标准曲线方程；向具有已知浓度内标物的混合内标溶液中，添加待检测样品离心后的第一上清液和沉淀蛋白试剂，并添加萃取剂，混匀，高速离心，取第二上清液；通过氮吹方式，吹干第二上清液，复溶液溶解吹干后的剩余物，高速离心，取第三上清液；利用高效液相串联质谱仪，检测第三上清液；基于检测结果和标准曲线方程，得到待检测样品中维生素K1和维生素K2(MK4)的浓度。本发明提供的方案实现了同时检测维生素K1和维生素K2(MK4)。

技术领域

本发明涉及维生素检测技术领域，特别涉及一种同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法。

背景技术

维生素K1和维生素K2均为脂溶性维生素，这两种维生素均是维持人体机能正常运行所必需的。其中，维生素K1参与肝内凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ等的合成，并且是凝血过程中纤维蛋白原转变成纤维蛋白的促进因子。维生素K2作为谷氨酸-γ-羧化酶的辅酶参与机体的正常凝血过程。

特别地，维生素K1缺乏可造成人体凝血障碍，导致凝血酶过低症、维生素K1缺乏症、新生儿自然出血症等。且有研究表明，人体内维生素K1过量可导致严重的不良反应，包括呼吸困难、过敏样反应、紫绀、过敏性休克等，累及系统/器官以呼吸系统损害、全身性损害为主。另外，研究发现，维生素K2对多种恶性肿瘤细胞有生长抑制作用，并可诱导肝细胞癌、卵巢癌等多种实体瘤和白血病骨髓增生异常综合征的细胞凋亡，具有明显的抗肿瘤作用，且与多种抗肿瘤药有协同作用。因此，检测血液中维生素K1和维生素K2则显得十分重要。

目前，国内外有关维生素K1、维生素K2(MK4)的测定方法主要是分开检测维生素K1和维生素K2(MK4)，目前尚未有同时测定血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的报道。

发明内容

本发明实施例提供了一种同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，实现了同时检测血液中的维生素K1和维生素K2(MK4)，有效地缩短了检测时间。

一种同时检测血液中维生素K1和维生素K2(MK4)的方法，包括：

利用高效液相串联质谱仪，分别检测至少三种浓度混合标准溶液，其中，所述混合标准溶液为具有内标物的维生素K1和维生素K2(MK4)混合标准溶液，且所述至少三种浓度混合标准溶液中内标物浓度一致；

根据所述至少三种浓度混合标准溶液的检测结果，分别拟合维生素K1的标准曲线方程以及维生素K2(MK4)的标准曲线方程；

向固定量的具有已知浓度内标物的混合内标溶液中，顺序添加待检测样品离心后的第一上清液和沉淀蛋白试剂，混合，并添加萃取剂，混合，高速离心，取第二上清液，其中，所述第一上清液的添加量为50～300μL；

通过氮吹方式，吹干所述第二上清液，通过复溶液溶解吹干后的剩余物，混合，高速离心，取第三上清液；

利用高效液相串联质谱仪，检测所述第三上清液；

基于所述第三上清液的检测结果和维生素K1的标准曲线方程以及维生素K2(MK4)的标准曲线方程，得到所述待检测样品中维生素K1和维生素K2(MK4)的浓度。

优选地，

所述高效液相串联质谱仪中，

高效液相色谱的色谱条件包括：

长度为50mm、内径为3.0mm以及填料粒径为2.7μm的C18色谱柱；

洗脱流动相为含0.05％-0.25％甲酸的甲醇以及含0.05％-0.25％甲酸的乙腈；

分析时长为4.0min；