[发明专利]可以改善自身免疫性疾病的免疫细胞及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种免疫细胞的制备方法，该方法包括：

体外分离并纯化外周血单个核细胞；

用细胞激活因子I激活外周血单个核细胞；其中，细胞激活因子I由IL-2、IL-1α、IFN-γ、IL-12组成，以生理盐水配置；

用细胞激活因子II将激活后的细胞进行扩增；其中，细胞激活因子II由IL-2、IFN-γ、IL-12组成，以生理盐水配置；

收获免疫细胞；

其中，细胞激活因子I含有IL-2浓度11000 IU/mL、IL-1α浓度7000 IU/mL、IFN-γ浓度900 IU/mL、IL-12浓度200 IU/mL，以生理盐水配置；

细胞激活因子II含有IL-2浓度4000 IU/mL、IFN-γ浓度7000 IU/mL、IL-12浓度6000IU/mL，以生理盐水配置。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，体外分离并纯化外周血单个核细胞的过程包括：

将已加入肝素抗凝处理后的外周血分装至离心管中，离心，弃上清，向管中加入AIMV培养基，制成淋巴细胞悬液；

然后加入到预置有淋巴细胞分离液的离心管中离心，离心后将淋巴细胞层转移到另一离心管中，加入AIMV培养基后离心，弃上清，再加入AIMV培养基后离心，弃上清，获得外周血单个核细胞；

向外周血单个核细胞中加完全培养基，制成细胞悬液。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述完全培养基是按照以下方法进行操作的：

全血离心，弃上清，4℃静置过夜，再离心，取上清作为向AIMV培养基中添加的血浆；

向AIMV培养基中加入上述血浆，并按100U/ml浓度加入庆大霉素，制成含10v/v%自身血浆的完全培养基。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，用细胞激活因子I激活外周血单个核细胞的过程包括：

向每20ml细胞悬液中加入细胞激活因子I 0.5ml，于38.5℃、6.5%CO₂的恒温培养箱中培养72小时；

用细胞激活因子II将激活后的细胞进行扩增的过程包括：

接种细胞72h后，将培养物转移至离心管中，离心；弃上清，RPMI1640培养基混悬细胞，并调整细胞密度0.5×10⁶-1×10⁶个/ml，加入AARI细胞激活因子II；将细胞悬液加入到未包被的细胞培养瓶中，于38.5℃、6.5% CO₂的恒温培养箱中继续培养72小时。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，收获免疫细胞的过程包括：

将细胞培养产物离心，弃上清，并用含白蛋白的生理盐水或RPMI1640培养基混悬细胞，冻存。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，免疫细胞的冻存步骤包括：

将细胞培养产物离心，弃上清，加入预冷过的冻存液A重悬，充分混匀后置冰上，缓慢加入预冷过的冻存液B，充分混匀后立即转入冻存管中，-80℃保存；

所述冻存液A为：向浓度为200 g/L的人血清白蛋白溶液每100mL中加入100 mL pH7.0的PBS缓冲液；混匀后-20℃保存；

所述冻存液B为：pH7.0的PBS缓冲液与二甲基亚砜按照4：1体积比混匀即得。

7.一种免疫细胞，其是根据权利要求1~6任一项所述的方法制备得到的。

8.权利要求7所述的免疫细胞在制备用于改善自身免疫性疾病的制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述用于改善自身免疫性疾病的制剂是通过皮内注射、静脉注射、肌内注射或在所述肿瘤内部或周围给药，给药剂量为每次50万-3000万免疫细胞。

10.根据权利要求8所述的应用，其中，所述用于改善自身免疫性疾病的制剂是通过将免疫向Th1方向调节，加强患者的Th1反应，平衡Th1/Th2；缓解自身免疫性疾病的症状；所述自身免疫性疾病包括过敏性鼻炎、哮喘、花粉过敏及类风湿性关节炎。