[发明专利]靶向PD-L1微泡的制备方法及在制备抑制宫颈癌的药物上的应用

说明书

本发明涉及一种靶向PD‑L1微泡的制备方法，具体是将生物素化脂质微泡滴加链酶亲和素孵育，加入生物素化的PD‑L1抗体，经孵育后离心得到靶向PD‑L1微泡。本发明将靶向PD‑L1微泡应用于制备抑制宫颈癌移植瘤的药物上，实验结果表明靶向PD‑L1微泡具体更高的抑瘤效果，其中体积抑瘤率为39.21%，质量抑瘤率为44.44%。

技术领域

本发明涉及一种脂质微泡，具体为靶向PD-L1微泡，并将其应用于制备治疗宫颈癌。

背景技术

宫颈癌是全世界女性最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌高居妇科恶性肿瘤第二位，发病率高且逐渐趋于年轻化，严重危害女性健康。宫颈癌主要是由于人乳头瘤病毒(HPV)感染造成，目前认为高危型HPV持续感染、机体的免疫功能下降及宫颈癌局部微环境之间的相互作用，促进宫颈癌的发生发展。当前治疗方法包括手术切除、放疗、化疗。手术是治疗宫颈癌的主要方法之一，虽然手术能暂时切除病灶，但肿瘤细胞具有很强的侵袭性和转移性，病灶并不能完全切除。辅助化疗在临床上被广泛用于术前和术后治疗，能够有效地降低肿瘤分期、减少宫旁浸润，为手术提供了良好的条件，但化疗的靶向性差，易产生耐药，全身毒副作用明显。宫颈癌是放射敏感性肿瘤，放疗对于中晚期患者和复发患者的效果是得到肯定的，但其严重的并发症给治疗带来极大的困难。因此探索宫颈癌的发病机制，寻找宫颈癌治疗的新靶点，对宫颈癌的早期诊断、治疗及预后评估具有重要的临床意义。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种靶向PD-L1微泡，并将其应用于制备抑制宫颈癌移植瘤的药物。进一步优选方案中，应用于制备抑制U14宫颈癌细胞的药物。

所述的靶向PD-L1微泡是通过薄膜水化法及机械震荡法制备的生物素化脂质微泡，具体步骤包括如下：

(1)将二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素(DSPE-PEG2000-Biotin)、硬脂酸—聚乙酰亚胺(PEI-600)混于玻璃试管中，60℃水浴锅预热后，涡旋状态下充入氮气使混合液成膜于试管壁；(二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素(DSPE-PEG2000-Biotin)、硬脂酸—聚乙酰亚胺(PEI-600)，均为美国Avanti公司购买)。

二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素、硬脂酸—聚乙酰亚胺摩尔比75-90:3-6:3-6:2-6。

优选方案中二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素、硬脂酸—聚乙酰亚胺摩尔比85:5:5:5。

(2)将步骤(1)中成膜后的玻璃管抽真空(抽真空3h以上，使液体充分挥发)后，加入Tris缓冲液，水浴超声(使玻璃管壁上的薄膜充分溶解于Tris缓冲液中，液体澄清后停止水浴超声)后置于西林瓶中密封，冲入C₃F₈气体，冷藏保存；

(3)将步骤(2)中冷藏后的西林瓶经振荡后得到白色乳状液体(一般震荡25-30s)；将该白色乳状液体移经离心(在1000rpm的离心速度下离心3min)后弃去下层液体即为生物素化脂质微泡(下层液体为游离的脂质和杂质)；

(4)向步骤(3)中生物素化脂质微泡滴加链酶亲和素(美国Avanti公司购买)，在2-4℃、避光下恒温振荡孵育，得到微泡混悬液；

(5)将步骤(4)中的微泡混悬液离心(在1000rpm的离心速度下离心3min)后，弃去下清液(以除去游离的链酶亲和素)后，采用PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清(优选方案为重复PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清的步骤3次)，得到微泡；