[发明专利]一种利用LC-PRM/MS进行血红蛋白非酶促修饰位点的定量方法及其应用

权利要求书

1.一种利用LC-PRM/MS进行血红蛋白非酶促修饰位点的定量方法及其应用，其特征在于：

1)在血红蛋白修饰位点鉴定过程中，人为将不同化合物分别与血红蛋白进行孵育，孵育后的血红蛋白以及人体提取的血红蛋白分别利用不同种酶进行酶解处理，对酶解的每个组分进行质谱鉴定分析。

2)根据质谱鉴定的结果获取修饰位点的信息并建立修饰位点谱库，同时利用不同种类酶酶解产生的内源非修饰肽段作为内标在平行反应监测模式下对修饰肽段定量分析结果进行保留时间校正，此时相当于进行无标记修饰肽段的定量分析。

3)进行平行反应监测前，将不同种酶获得的酶解肽段等体积混合，然后进行质谱定量分析，随后进行数据处理并寻找潜在的糖尿病早期诊断糖化肽段生物标志物。

2.依照权利要求1所述的人为将不同化合物与血红蛋白进行孵育，其特征在于孵育的步骤如下：

将化合物(包括但不仅限于葡萄糖、丙酮醛及乙醛酸)分别与人体血红蛋白按照1:500～1:3000摩尔比在37℃下磷酸盐缓冲液中进行孵育24小时以上。

3.依照权利要求1所述的孵育后的血红蛋白以及人体提取的血红蛋白分别进行不同种酶进行酶解处理，其特征在于：孵育后血红蛋白和人体血红蛋白提取等处理步骤如下：

1)孵育后血红蛋白经离心超滤步骤除去多余的盐及其他小分子，然后对血红蛋白进行定量。

2)人体血红蛋白提取：移取50μL红细胞于1.5mL的离心管中，然后加入1.5倍于血红蛋白体积的冰冻去离子水进行冰冻裂解红细胞，加入600μL的冷冻的盐酸异丙醇溶液(v/v99.5％:0.5％)涡旋混匀、离心后获取上清液，向上清液加入500μL的冰冻乙酸乙酯进行沉淀并继续利用乙酸乙酯对沉淀离心洗涤两次后，用氮吹将其吹干或在通风橱中自然晾干后即可获得血红蛋白。

4.根据权利要求1所述的分别利用不同种酶进行酶解处理，其特征在于：不同种酶分别为胰蛋白酶、凝乳胰蛋白酶和金黄色葡萄球菌V8蛋白酶，以血红蛋白与酶质量比为20-100之间分别进行酶解。

5.根据权利要求1所述的对酶解的每个组分进行质谱鉴定分析，其特征在于：利用LC-MS/MS分别对三种酶酶解后的体外孵育血红蛋白和人体血红蛋白的酶解产物进行分析鉴定。其中色谱条件如下：色谱柱为C₁₈，所采用流动相A(乙腈)和流动相B(甲酸水溶液)进行梯度洗脱。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：用质谱数据依赖采集模式采集分离后的多肽二级谱图，质谱数据采集策略如下：先用质谱采集色谱出峰多肽一级信号，依一级信号多肽信号强弱的不同，依次选择最强的多肽，采集其二级质谱数据。

7.根据权利要求1所述的根据质谱鉴定的结果获取修饰位点的信息建立修饰位点谱库，在特征在于：质谱鉴定过程中修饰位点定义为血红蛋白的N-末端缬氨酸和血红蛋白中所有的赖氨酸，其中修饰可分别设为“-C₆H₁₀O₅”、“-C₂H₂O₂”、“C₃H₄O₂”及以上修饰的脱水产物或其他可与血红蛋白结合的化合物。

8.根据权利要求1所述的利用不同种类酶酶解产生的内源非修饰肽段作为内标对平行反应监测模式下修饰肽段定量分析结果进行保留时间校正，其特征在于：内源非修饰肽段分别来自于三种酶解的肽段产物，分别为来自胰蛋白酶的VGAHAGEYGAEALER、LHVDPENFR、VNVDEVGGEALGR、LLVVYPWTQR，凝乳胰蛋白酶的TNAVAHVDDMPNAL、LASVSTVL、GAEALERMF以及金黄色葡萄球菌V8蛋白酶ALGRLLVVYPWTQRFFE和VGGEALGRLLVVYPWTQRFFE。