[发明专利]一种利用LC-PRM/MS进行血红蛋白非酶促修饰位点的定量方法及其应用

说明书

本发明公开一种利用LC‑PRM/MS进行血红蛋白非酶促修饰位点的定量方法及其应用。该方法包括：1)分别将小分子标准溶液与血红蛋白进行体外孵育，获得体外修饰血红蛋白样本；2)提取人体血液中血红蛋白；3)用LC‑MS/MS分别对胰蛋白酶、凝乳胰蛋白酶和金黄色葡萄球菌V8蛋白酶酶解后所获得的体内外血红蛋白肽段进行检测；4)从检测结果中得出血红蛋白修饰位点信息分布并建立修饰位点谱库；5)将酶解后的血红蛋白肽段混合进行监测实验；6)根据修饰位点谱库，利用LC‑PRM/MS进行糖尿病早期诊断的肽段标志物筛选。本发明可提高血红蛋白修饰位点覆盖度、获得准确定量结果，有望为糖尿病早期筛查提供一种参考方法。

技术领域

本发明属于蛋白修饰位点鉴定方法及定量分析应用，具体涉及一种利用 LC-PRM/MS进行血红蛋白非酶促修饰位点的定量方法及其应用。

背景技术

糖尿病是临床常见的一种复杂的、以高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，长期的血糖升高会造成机体大血管、微血管并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等各器官组织的严重损害的临床综合征。因此，有效加强型糖尿病的防治工作是当前极其重要且有意义的工作。

对糖尿病的诊断，传统的检测项目是空腹血糖(Fasting plasma glucose， FPG)和口服糖耐量试验(Oral glucose tolerance test，OGTT)。然而以上两种手段有自身的不足，如个体内和个体间的生物学变异较高，影响临床诊断的准确性。糖化血红蛋白(Glycated hemoglobin，HbA1c)由于其半衰期周期长，浓度只与红细胞寿命和体内血糖的平均浓度相关，不受运动或食物的影响，在临床上可代表最近2-3个月内的血糖浓度的平均值，是国际公认用于评估糖尿病患者血糖状况的金标准(Kasia J.Lipska,HarlanM.Krumholz.(2017)“Is hemoglobin a1c the right outcome for studies ofdiabetes？”JAMA,317(10),1017-1018)。

目前，用于检测HbA1c的方法多种多样，包括离子交换色谱法、电泳法、亲和色谱法、酶化学法等。虽然以上各种方法均可实现HbA1c的定量检测，但无法确定血红蛋白上结合的糖基化位点、数量以及其他氨基酸被修饰状态，即无法进一步提供血红蛋白被修饰的位点、数量及其功能变化与糖尿病各种症状的关系。

相较于其他的检测方法，质谱法具有分析速度快、灵敏度高、多组分同时分析、精确的定性定量分析能力等优势，被称为“最精密的天平”，已被广泛应用于化学、医学、生命科学等诸多领域，贯穿于基因组学、转录组学、蛋白质组学等多个研究领域的发展中，是精准医疗工作开展过程中不可或缺的重要环节 (Pinho S.S.and Reis C.A.(2015).“Glycosylation in cancer:mechanisms and clinical implications”.Nature ReviewsCancer,15,540)。虽然已有文献报道利用质谱法可进行糖化血红蛋白糖化位点的修饰，但仅用单一酶进行血红蛋白酶解容易丢失部分修饰位点信息，且并未定量研究各个修饰位点与糖尿病的相关性 (Priego-Capote F.,Ramirez-Boo M.and Hoogland C.(2011).“Humanhemolysateglycated proteome.”Analytical Chemistry,83(14),5673-5680)。由于血红蛋白的多个位点可与机体中活性小分子进行结合，但利用多种酶解方式进行血红蛋白酶解并利用血红蛋白未被修饰的酶解肽段作为内标进行修饰位点的定量分析及在糖尿病的诊断价值的研究未曾报道。因此，整合多种酶解方式进行血红蛋白酶解获取丰富的修饰位点信息并进行定量分析对研究糖尿病的发展过程非常关键。

发明内容