[发明专利]一种耦合ATP再生系统的催化体系及其在生产谷胱甘肽过程中的应用

说明书

本发明公开了一种耦合ATP再生系统的催化体系及其在生产谷胱甘肽过程中的应用。首先分别构建外源表达/基因组整合的含谷胱甘肽合成双功能酶和ATP再生酶的大肠杆菌，再进行谷胱甘肽合成反应条件以及催化体系的优化，最后，通过两种大肠杆菌混合培养以及菌种比例和催化反应工艺的优化，实现谷胱甘肽的生产，最大程度节约原料、设备以及合成反应过程的成本。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种耦合ATP再生系统的催化体系及其在生产 谷胱甘肽过程中的应用。

背景技术

谷胱甘肽(γ-L-glutamyl-cysteinyl-glycine，GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三种 氨基酸缩合得到的一种小分子多肽，广泛存在于各种生物体内，是微生物及植物生物细胞内 最主要含巯基的小分子肽。谷胱甘肽是体内一种重要的抗氧化剂。还原型的谷胱甘肽在活组 织中具有许多重要的功能，在肝损伤、眼部疾病、物质代谢，调节细胞凋亡等方面发挥着重 要的作用。此外，其在食品保鲜领域也发挥同样重要的作用，因此国内外医药市场、食品， 化妆品领域对于谷胱甘肽的需求也在稳步提升。

目前谷胱甘肽的制备方法很多，常见的包括溶剂萃取法、化学合成法、生物发酵法和酶 法。萃取法从谷物胚芽等含有大量谷胱甘肽的植物中提取谷胱甘肽，存在得率低、成本高、 有机溶剂污染严重、纯度不高等缺点，现已较少使用。化学合成法合成谷胱甘肽活性产物不 易分离，需要化学拆分，产品纯度不高，难以推广。因此，目前国内外生产谷胱甘肽多是采 用发酵法或酶法，发酵法是将编码合成谷胱甘肽酶系或者双功能酶的基因克隆到细菌或酵母 中，发酵培养获得谷胱甘肽。发酵法中酵母发酵法工艺较成熟，但生产周期长，产量偏低， 且过多的副产物使下游工艺处理复杂，环境污染较大。专利CN201810844388和CN201680013630分别在酵母和大肠杆菌中外源表达谷胱甘肽合成双功能酶基因，达到发酵生 产谷胱甘肽的目的，但是产量很低，不适合批量化生产。

酶法生产谷胱甘肽具有工艺明确，底物转化率高，产品纯度高等优点，已引起了人们的 广泛关注。新发现的双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)逐渐取代原有的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 (Gsh I，EC 6.3.2.2)和谷胱甘肽合成酶(Gsh II，EC 6.3.2.2)两种酶，用来酶法催化生产GSH， 反馈抑制作用较小，适合应用于大规模生产。但是，现有技术中，依然存在各种问题妨碍该 技术的工业化应用，专利CN201710543648获得了氨基酸序列不同的GshF-4突变体，其合 成活力、比活以及最适温度都有所提高，但是存在产量偏低；ATP消耗量大，成本高的问题， 不利于工业化生产。

酶法合成谷胱甘肽需要三磷酸腺苷(ATP)作为能量供体，但是ATP的价格会大幅提高生 产成本，因此建立ATP再生系统是谷胱甘肽合成中关键的一环。专利CN201310538982在大 肠杆菌细胞中过表达(外源的)谷胱甘肽双功能酶(STH)以及乙酸激酶(ack)，获得重组表达细 胞，虽然达到了ATP再生的目的，但是Rosetta(DE3)稳定性并不高，所需要的底物乙酰磷酸 二锂盐成本高，且产物产量低，破碎酶液提高分离成本，此外，还有质粒存在丢失可能的问 题，以及抗生素的使用对环境并不友好的问题，难以进行工业推广；专利CN201710452240 利用GshF酶、ATP再生酶(PPK酶和PAP酶)和AK酶在反应器中生成谷胱甘肽，使用腺 苷替代ATP或AMP，但是其中的ATP再生酶系统包含PPK酶、PAP酶和AK酶多种酶存在 分别培养导致成本增高的问题，以及固定化分离步骤繁琐，能耗高，此外，还有质粒存在丢 失可能的问题；抗生素的使用对环境并不友好的问题等，最终导致其无法很好的在工业上推 广。

发明内容

为了解决上述问题，本发明选择了PPK2家族中可利用AMP/ADP催化核苷酸磷酸化的红 假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)来源的ppk2基因作为ATP循环再生的酶，获得一种耦 合ATP再生系统的催化体系。实现了在低成本的六偏磷酸钠存在下可催化ADP和AMP的磷 酸化，催化产物的高能磷酸键断裂为谷胱甘肽的合成反应供能。