[发明专利]羊毛硫肽的筛选方法及无细胞蛋白合成体系和羊毛硫肽

权利要求书

1.一种通过高通量筛选获得羊毛硫肽的方法，其特征在于，利用无细胞蛋白合成体系通过高通量筛选获得目标羊毛硫肽，所述无细胞蛋白合成体系由：nisB蛋白、nisC蛋白、含有nisP的表达载体、细胞提取物和氨基酸预混液组成；所述氨基酸预混液为含有等浓度基本氨基酸的混合液，包括精氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸；

所述筛选方法包括：

1）基于参考羊毛硫肽的序列，在所述参考羊毛硫肽的不同位点进行饱和突变，以便确定候选羊毛硫肽，所述参考羊毛硫肽为乳酸链球菌素，所述不同位点为乳酸链球菌素的4，12，15，24和29位氨基酸位点；

2）将所述候选羊毛硫肽的核心肽编码序列和前导肽序列相连，所述连接产物和载体连接，构建重组表达载体，以便获得突变体文库；

3）利用微生物菌株对所述突变体文库进行转化表达，以便获得单克隆菌株；

4）将所述单克隆菌株培养，破菌，分离获得所述重组表达载体；

5）所述重组表达载体、细胞提取物和氨基酸预混液进行接触反应，以便获得所述候选羊毛硫肽；

6）基于所述候选羊毛硫肽的不同性能，筛选获得目标羊毛硫肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过震荡进行所述破菌，通过离心进行所述分离。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述载体为质粒或DNA模板。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）中所述细胞提取物为大肠杆菌细胞提取物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌细胞提取物通过下述方法获得：

培养大肠杆菌，收集获得大肠杆菌菌体；

将所述大肠杆菌菌体进行高压冷冻破碎，收集上清，以便获得所述大肠杆菌细胞提取物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）中在25~40摄氏度下进行所述接触反应。