[发明专利]羊毛硫肽的筛选方法及无细胞蛋白合成体系和羊毛硫肽

说明书

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种羊毛硫肽的筛选方法及无细胞蛋白合成体系和羊毛硫肽。该筛选方法包括：(1)基于参考羊毛硫肽的序列，确定候选羊毛硫肽；(2)将所述候选羊毛硫肽的核心肽编码序列与前导肽序列相连，所得连接产物和载体连接，以便获得重组表达载体；(3)将所述重组表达载体、细胞提取物和氨基酸预混液进行接触反应，以便获得所述候选羊毛硫肽；(4)基于所述候选羊毛硫肽的不同性能，筛选获得目标羊毛硫肽。该方法利用无细胞蛋白合成体系可以方便快速获得目标羊毛硫肽。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种羊毛硫肽的筛选方法及无细胞蛋白合成体系和羊毛硫肽。

背景技术

羊毛硫肽是一种典型的核糖体肽，是指含有硫醚键的环肽类化合物，目前在这类化合物中发现了多种生理活性物质，包括抗菌、抗病毒、镇痛、预防龋齿等。1928年Rogers报道了从Lactococcus lactis中分离的“明星”化合物乳酸链球菌素nisin，发现其对革兰氏阳性菌的抗菌活性很强。Nisin作为一种食品添加剂目前已经在世界上多个国家使用，在数十年的使用历史中没有常出现明显的nisin抗性菌。Nisin通过与膜结合的细胞壁结合前体脂质II，导致肽聚糖的抑制合成和形成膜孔，从而杀死革兰氏阳性细菌。

已有的羊毛硫肽活性不足，或者应用有限，还不能满足生产的需求，需要一种能够更全面、更快速挖掘新的羊毛硫肽的方法。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种羊毛硫肽的筛序方法及无细胞蛋白合成体系和羊毛硫肽。

在获取羊毛硫肽的过程中，nisin的生物合成途径作为一种特别的机制，具有重要的借鉴意义。nisin的生物合成途径研究非常清晰，以nisin Z为例，由基因簇上的nisZ基因合成前体肽NisZ，前体肽由leader peptide和core peptide构成，再由脱水酶NisB进行脱水，环化酶NisC进行环化形成羊毛硫氨酸环，这两个酶都是先识别前导区的保守序列再将核心肽区域的相关氨基酸进行催化，修饰后的前体肽(mLanA)也被蛋白酶NisP识别前导区的序列后再对特定的序列“GASPR|IT”进行切割而去除leader区域，最终形成成熟的nisin(如图1所示)。Van Heel等(van Heel et al.,2016)利用nisin这种特别的机制做出了出色的对羊毛硫肽的基因组挖掘工作，通过融合潜在的多肽的核心肽与nisin前导肽形成杂交前体，并通过将前体转入L.lactis中与NisBC和NisT(转运蛋白)共表达，通过发酵和MALDI-TOF检测，他们检测到54个候选者中的27个被NisBC脱水，并且在他们的研究中开发了5个与nisin类似的核心肽的新型羊毛硫肽，其具有抗菌活性。但是由于羊毛硫肽往往具有抗菌生物活性，在体内表达不能筛选出对宿主有毒性的羊毛硫肽，因此该方法具有一定的局限性。而且在体内表达需要将菌株进行单独发酵提取检测，过程繁琐，周期较长，使得对化合物的挖掘速率变慢。

因此，需要一种能够更全面、更快速挖掘新的羊毛硫肽的方法。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种羊毛硫肽的筛选方法，包括：(1)基于参考羊毛硫肽的序列，确定候选羊毛硫肽；(2)将所述候选羊毛硫肽的核心肽编码序列和前导肽序列相连，所得连接产物和载体连接，以便获得重组表达载体；(3)将所述重组表达载体、细胞提取物和氨基酸预混液进行接触反应，以便获得所述候选羊毛硫肽；(4)基于所述候选羊毛硫肽的不同性能，筛选获得目标羊毛硫肽。