[发明专利]高亲和力的抗猪CD40试剂设计方法以及相应的抗猪CD40试剂

权利要求书

1.一种高亲和力的抗猪CD40试剂设计方法，其中，所述抗猪CD40试剂设计方法包括：

S1：在猪CD40L基因编码序列的氨基端和羧基端分别插入XhoI和BamHI酶切位点，在限制性内切酶的作用下获得带有XhoI、BamHI位点的第一段猪CD40L目的基因(基因序列I)；

S2：以携带XhoI、BglII酶切位点的p40LBgL以及携带EcoRI酶切位点的P40Eco为PCR模板进行扩增，获得扩增目的基因；在所述扩增目的基因中，插入表达质粒pwPICZalpha；

S3：通过XhoI、EcoRI酶切位点，对所述扩增目的基因进行酶切，获得带有BglII、EcoRI位点的第二段猪CD40L目的基因(基因序列II)；

S4：将带有XhoI、BamHI位点的所述基因序列I以及带有BglII、EcoRI位点的所述基因序列II进行连接，得到猪CD40L二聚体基因序列；在所述猪CD40L二聚体基因序列中插入表达质粒pwPICZalpha，得到含有所述猪CD40L二聚体基因序列的表达载体；

S5：将所述表达载体通过毕赤酵母表达系统进行表达，获得可溶性猪CD40L二聚体。

2.如权利要求1所述的抗猪CD40试剂设计方法，其中，所述步骤S3中，在对所述扩增目的基因进行酶切前，需获取相应序列后进行测序，测序确认后再进行酶切。

3.如权利要求1所述的抗猪CD40试剂设计方法，其中，所述步骤S4中，所述基因序列I的BamHI位点和所述基因序列II的BglII位点相连。

4.如权利要求1所述的抗猪CD40试剂设计方法，其中，所述步骤S4中，通过对XhoI和EcoRI酶切位点进行检测，筛选含有猪CD40L二聚体基因序列的表达载体。

5.如权利要求1所述的抗猪CD40试剂设计方法，其中，所述步骤S5中，所述表达载体通过所述毕赤酵母表达系统进行表达的表达步骤包括：

a1：使用限制性内切酶线性化重组表达载体，通过电转化的方法，将猪CD40L二聚体基因序列整合到毕赤酵母的基因组中；

a2：将转化后的毕赤酵母菌体悬液涂布于平板上，30℃培养3－4d；

a3：挑取6个单菌落，进行小剂量的诱导表达，并检测表达上清，确认阳性克隆菌落；

a4：挑选阳性克隆菌落进行大剂量的诱导表达，纯化表达上清，并检测猪CD40L二聚体的结合能力。

6.如权利要求5所述的抗猪CD40试剂设计方法，其中，所述步骤a2中，所述平板为含有Zeocin的YPD平板。

7.如权利要求5所述的抗猪CD40试剂设计方法，其中，所述步骤a3中，采用SDS－PAGE检测表达上清。

8.如权利要求5所述的抗猪CD40试剂设计方法，其中，所述步骤a4中，表达上清采用ProteinPureN1－NTA树脂和强阳离子交换树脂纯化。

9.如权利要求5所述的抗猪CD40试剂设计方法，其中，所述步骤a4中，通过SDS－PAGE和Westernblot检测经过纯化的猪CD40L二聚体的结合能力。

10.一种由权利要求1－9之一所述设计方法得到的抗猪CD40试剂，其中，所述抗猪CD40试剂含有所述猪CD40L二聚体。