[发明专利]高亲和力的抗猪CD40试剂设计方法以及相应的抗猪CD40试剂

说明书

本发明提供了一种高亲和力的抗猪CD40试剂设计方法，其包括：S1：在限制性内切酶的作用下获得带有XhoI、BamHI位点的第一段猪CD40L目的基因(基因序列I)；S2：以携带XhoI、BglII酶切位点的p40LBgL以及携带EcoRI酶切位点的P40Eco为PCR模板进行扩增，获得扩增目的基因；在扩增目的基因中，插入表达质粒pwPICZalpha；S3：通过XhoI、EcoRI酶切位点，对扩增目的基因进行酶切，获得带有BglII、EcoRI位点的第二段猪CD40L目的基因(基因序列II)；S4：将基因序列I以及基因序列II进行连接，得到猪CD40L二聚体基因序列；在猪CD40L二聚体基因序列中插入表达质粒pwPICZalpha，得到含有猪CD40L二聚体基因序列的表达载体；S5：将表达载体通过毕赤酵母表达系统进行表达，获得可溶性猪CD40L二聚体。本发明还提供了一种抗猪CD40试剂，其含有上述猪CD40L二聚体。

技术领域

本发明涉及一种高亲和力的抗猪CD40试剂设计方法以及相应的抗猪CD40试剂。

背景技术

在人体的获得性免疫应答中，CD40－CD40L之间的相互作用是T细胞与抗原呈递细胞间一个非常重要的共刺激通路。在动物疾病模型的研究中，需要使用猪来创建动物模型并进行相应的检测。

CD40配体(CD40L)属于TNF(肿瘤坏死因子)家族的一员，是一个II型跨膜糖蛋白，主要表达在活化CD4+T细胞、一小部分CD8+T细胞和血小板上。CD40L可能以异源二聚体复合物的形式表达，并被金属蛋白酶从跨膜蛋白上分离下来。可溶性CD40L像细胞因子一样与CD40结合后，传递生物信号；通过与表达在抗原呈递细胞表面的CD40结合，启动抗原呈递细胞与T细胞之间的关键共刺激通路，激活抗原呈递细胞和T细胞，转化抗体亚型，并促进生发中心形成。此外，它们能够活化细胞毒性T细胞，降低免疫抑制，调节肿瘤细胞的生存并将与肿瘤相关性抗原呈递给免疫系统，在获得性免疫反应中起着重要的作用。

目前，市面上已经有针对不同物种的CD40单克隆抗体(mAb)，但是在小型猪移植模型中进行移植耐受和免疫调节研究时，并没有成熟的商业化猪CD40荧光标记单克隆抗体用于直接使用。虽然有研究人员认为，跨物种的CD40抗体(如抗人类CD40mAbs)也可用于猪CD40的检测，然而，对于跨物种的抗原抗体反应，结合亲和力要么极低，要么根本不结合，在实际应用中带来很多的困难，影响了相应研究的进行。

因此，如何提供一种结合亲和力高，可用生物素标记的抗猪CD40试剂成为了业界需要解决的问题。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种高亲和力的抗猪CD40试剂设计方法，其能够得到结合亲和力高，可用生物素标记的抗猪CD40试剂。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种高亲和力的抗猪CD40试剂设计方法，该抗猪CD40试剂设计方法包括：

S1：在猪CD40L基因编码序列的氨基端和羧基端分别插入XhoI和BamHI酶切位点，在限制性内切酶的作用下获得带有XhoI、BamHI位点的第一段猪CD40L目的基因(基因序列I)；

S2：以携带XhoI、BglII酶切位点的p40LBgL以及携带EcoRI酶切位点的P40Eco为PCR模板进行扩增，获得扩增目的基因；在扩增目的基因中，插入表达质粒pwPICZalpha；

S3：通过XhoI、EcoRI酶切位点，对扩增目的基因进行酶切，获得带有BglII、EcoRI位点的第二段猪CD40L目的基因(基因序列II)；

S4：将带有XhoI、BamHI位点的基因序列I以及带有BglII、EcoRI位点的基因序列II进行连接，得到猪CD40L二聚体基因序列；在猪CD40L二聚体基因序列中插入表达质粒pwPICZalpha，得到含有猪CD40L二聚体基因序列的表达载体；