[发明专利]一种用于治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法

权利要求书

1.一种用于治疗骨关节炎的细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述制剂的制备方法包括以下步骤：

(1)从健康成人骨髓中通过密度梯度离心的方法获得单个核细胞；

(2)免疫磁珠筛选骨髓单个核细胞以获得BMSC；

(3)对步骤(2)中获得BMSC进行流式分选，获得CD151+CD271+的细胞亚群；

(4)对获得的细胞亚群进行处理，制成制剂。

2.按照权利要求1所述的一种用于治疗骨关节炎的细胞制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的健康人骨髓来源于自体或异体，获得途径可以是直接骨穿抽取骨髓或由骨髓库直接购买的健康人骨髓样本。

3.按照权利要求1所述的一种用于治疗骨关节炎的细胞制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的密度梯度离心以获取单个核细胞的操作为：

①将采血管经酒精浸润的无尘纸擦拭后放入生物安全柜，抽取采血管中的骨髓分装到15ml的离心管中，每管骨髓9ml，加入1.5ml PE buffer稀释，并通过提前双面润湿的100μm筛网过滤；

②在新的15ml离心管底部加4.5ml Ficoll-Pague分离液，倾斜离心管，再将滤过的骨髓，缓慢加到Ficoll-Pague分离液面上，使其呈清晰的界面，尽量避免出现骨髓侵入到分离液面之下，在离心力为500g、温度为20度的条件下离心35分钟；

③离心后液面将分为4层，从底部向上分别为红细胞、Ficoll层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加PE buffer 12ml，混匀洗涤，在离心力为300g、温度为20度的条件下离心10分钟；

④离心后弃上清，细胞沉淀先用15ml PE buffer重悬，混匀，在离心力为200g、温度为20度的条件下离心12分钟；

⑤离心后弃上清，细胞沉淀用10ml PE buffer重悬，得到单个核细胞的细胞悬液。

4.按照权利要求3所述的一种用于治疗骨关节炎的细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述PE buffer为免疫磁珠分选所用的洗涤缓冲液。

5.按照权利要求1所述的一种用于治疗骨关节炎的细胞制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的获得BMSC的操作为：

①将步骤(1)获取的单个核细胞的细胞悬液进行细胞计数，并在离心力为300g、温度为20度的条件下离心10分钟；

②根据细胞计数的结果，以每10⁷个细胞60μl PBE buffer的比例加入缓冲液重悬细胞；

③根据细胞计数的结果，以每10⁷个细胞20μl的比例分别加入CD271磁珠和FcR阻断剂，充分混匀后，于4度下冷却15分钟；

④根据细胞计数的结果，以每10⁷个细胞1.5ml PBE buffer的比例加入缓冲液洗涤经过冷却后的细胞，混匀后在离心力为300g、温度为4度的条件下离心10分钟；

⑤根据细胞计数的结果，以每10⁸个细胞500μl PBE buffer的比例加入缓冲液重悬细胞，若细胞数低于10⁸个，至少添加500μl PBE buffer重悬；将细胞悬液转移至专用的分选管中，使用全自动磁珠分选仪进行细胞分选，筛选得到CD271阳性的BMSC细胞。

6.按照权利要求5所述的一种用于治疗骨关节炎的细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述PBE buffer为免疫磁珠分选所用的运行缓冲液。