[发明专利]一种用于治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法

说明书

本发明公开了一种用于治疗骨关节炎的细胞制剂及制备方法，所述制剂的制备方法包括以下步骤：(1)从健康成人骨髓中通过密度梯度离心的方法获得单个核细胞；(2)免疫磁珠筛选骨髓单个核细胞以获得BMSC；(3)对步骤(2)中获得BMSC进行流式分选，获得CD151+CD271+的细胞亚群；(4)对获得的细胞亚群进行处理，制成制剂。本发明在现有的BMSC提取技术的基础上，发明了一种利用细胞表面抗原标记，阶梯式特异性分离具有高软骨分化能力的细胞亚群的方法，经处理，获得用于治疗骨关节炎的CD151+CD271+的细胞亚群制剂，克服现阶段BMSC治疗骨关节炎促成软骨分化的细胞占比较少，疗效不佳等问题。

技术领域

本发明涉及一种具有特异性促软骨分化作用治疗骨关节炎细胞制剂的制备方法。本发明也涉及将通过本发明富集的细胞制剂用于制备骨关节炎治疗药物中的应用。

背景技术

骨关节炎是骨科领域患病率最高的一种退行性病变。调查显示，全世界骨关节炎患者有3.6亿人，我国有1.3亿多，占人口总数10％以上，其中，60岁以上50％以上患病，70岁以上骨关节炎发病率达80-90％，远超心脑血管等疾病。目前临床上所用药物仅能够在一定范围和程度上改善症状延缓病情进展，却不能对其有效根治，后期关节变形只能借助外科手术矫正。

骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)是存在于骨髓中的一类具有“无限”增殖和多向分化潜能的干细胞，在不同条件下能向骨，软骨、脂肪、神经、心肌、骨骼肌等多方向分化，还因其具有贴壁易生长，体外易分离、扩增，外源性基因的易转入和表达的特性，而被生物医学专家认为是干细胞治疗的一种理想细胞类型。BMSC也具有强大的免疫调节和抗炎作用，能通过细胞间相互作用和多种因子的分泌来调节局部环境和活化内源性祖细胞，从而发挥修复骨关节炎受损组织的作用，这些特性使BMSC成为治疗骨性关节炎理想的种子细胞，但其依然无法克服本身的局限性，真正能够发挥软骨分化的细胞在总体中占比较少，这也导致了BMSC治疗效果有限。针对这一问题，发明人研究证实了BMSC中存在更为精细的功能分群，具有高分化成软骨能力的是特定的细胞亚群，因此，富集有效的细胞亚群将明显提高其在骨关节炎治疗中的疗效，为骨关节炎的干细胞治疗开启新的篇章。

发明内容

针对现有BMSC治疗骨关节炎，存在成软骨分化能力的BMSC含量较低的问题，发明人选用前期首次发现具有高分化成软骨能力的细胞亚群高特异性表达的表面抗原CD151，通过联合BMSC的特征表面抗原CD271，提供了一种简单高效的全新方法，可成功分离提纯这种具有高成软骨分化功能的细胞亚群(CD151+CD271+)，将其处理为细胞制剂用以治疗骨关节炎。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种用于治疗骨关节炎的细胞制剂的制备方法，所述制剂的制备方法包括以下步骤：

(1)从健康成人骨髓中通过密度梯度离心的方法获得单个核细胞；

(2)免疫磁珠筛选骨髓单个核细胞以获得BMSC；

(3)对步骤(2)中获得BMSC进行流式分选，获得CD151+CD271+的细胞亚群；

(4)对获得的细胞亚群进行处理，制成制剂。

本发明所述的一种用于治疗骨关节炎的细胞制剂的制备方法中，步骤(1)所述的健康人骨髓来源于自体或异体，获得途径可以是直接骨穿抽取骨髓或由骨髓库直接购买的健康人骨髓样本。

本发明所述的一种用于治疗骨关节炎的细胞制剂的制备方法中，步骤(1)所述的密度梯度离心以获取单个核细胞的操作为：

①将采血管经酒精浸润的无尘纸擦拭后放入生物安全柜，抽取采血管中的骨髓分装到15ml的离心管中，每管骨髓9ml，加入1.5ml PE buffer稀释，并通过提前双面润湿的100μm筛网过滤；