[发明专利]一种外周血多潜能细胞活性物联合富血小板血浆制备用于半月板损伤治疗的药物及其应用

说明书

本发明涉及干细胞制剂技术领域，特别涉及一种外周血多潜能细胞活性物联合富血小板血浆制备用于半月板损伤治疗的药物及其应用，包括多潜能细胞活性物、富血小板血浆裂解液、滑膜间充质干细胞、盐酸法舒地尔，所述多潜能细胞与所述滑膜间充质干细胞的比例为1∶0.5‑3，所述的滑膜间充质干细胞为原代培养的第2到5代细胞；所述的多潜能细胞活性物与富血小板血浆裂解液按照体积比1∶5～10；盐酸法舒地尔在药物中的浓度为15～30μmol/L。本发明作为细胞共培养，与半月板细胞在体外模拟体内多种细胞相互作用的内环境，利用细胞间相互作用对其它生理过程的影响，通过共培养形成多种细胞类型共存的组织并且相互维持帮助半月板细胞的生长。

技术领域

本发明涉及干细胞制剂技术领域，特别涉及一种外周血多潜能细胞活性物联合富血小板血浆制备用于半月板损伤治疗的药物及其应用。

背景技术

人类半月板与其他哺乳类动物相似，呈外侧厚而内侧较薄的楔形，表面光滑而富有光泽，质地坚韧弹性尚佳。对于半月板切除的患者，为了恢复半月板的功能，防止出现进一步的软骨损伤或骨关节炎半月板的移植和替代就成为了此类患者的最终选择。半月板移植又因为供体来源及受体匹配等原因无法在临床广泛应用。近年来，随着材料学、细胞生物学、分子生物学等基础学科的迅速发展，以干细胞为基础的组织工程技术已显示出良好的发展前景，并且成为当今生物学和医学关注的研究热点。组织工程半月板指利用天然或人工合成的有机或无机材料加入种子细胞通过一定条件复合培育而成的一种特殊半月板组织。组织工程半月板应用的种子细胞包括纤维软骨细胞(半月板细胞)、滑膜间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、软骨细胞等。半月板细胞属于终末分化细胞，体外培养中出现凋亡及去分化现象。在实验室操作中发现半月板细胞培养周期长，生长缓慢，且对体外环境的要求较高，半月板细胞很难在支架上生长。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种外周血多潜能细胞活性物联合富血小板血浆制备用于半月板损伤治疗的药物的应用，用于与半月板细胞共培养，促进组织工程中半月板支架的移植成功。

为解决上述的技术问题，具体技术方案：

一种外周血多潜能细胞活性物联合富血小板血浆制备用于半月板损伤治疗的药物，包括多潜能细胞活性物、富血小板血浆裂解液、滑膜间充质干细胞、盐酸法舒地尔，所述多潜能细胞与所述滑膜间充质干细胞的比例为1∶0.5-3，所述的滑膜间充质干细胞为原代培养的第2到5代细胞；所述的多潜能细胞活性物与富血小板血浆裂解液按照体积比1∶5～10；盐酸法舒地尔在药物中的浓度为15～30μmol/L。

其中，所述滑膜间充质干细胞来源于人、大鼠或猪。

进一步的，所述的多潜能细胞活性物的提取方法，包括以下步骤：

(1)外周血加入消化液，37℃恒温摇床培养，用含体积分数10％胎牛血清的M199培养基终止消化；所述的消化液添加有PMSF蛋白酶抑制剂的I型胶原酶、II型胶原酶、生理盐水；配置方法为：质量浓度为0.05％～0.15％的I型胶原酶与0.05％～0.15％的II型胶原酶的生理盐水溶液，加入消化液总质量1％的PMSF蛋白酶抑制剂，最后调节溶液的pH值为7.2～7.4。所得摇床培养条件为，摇床的转速为100～200r/min，培养30～50min。

(2)收集消化液，离心收集沉淀物，以生理盐水重悬细胞，得到复合外周血干细胞；

(3)应用磁珠标记的Dlk抗体和Sca1抗体，以磁珠筛选法从复合外周血干细胞中筛选出CD34^+/CD90^+外周血干细胞；