[发明专利]一种具有高分泌能力的普鲁兰酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种具有高分泌能力的普鲁兰酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明普鲁兰酶突变体胞外分泌能力较野生型有了明显的提高，将携带编码本发明普鲁兰酶突变体PulBd‑306的基因的大肠杆菌摇瓶诱导发酵44h，即可使发酵液上清液中的胞外酶活达38.9U·mLsupgt;‑1/supgt;，是野生型的2.3倍；将携带编码本发明普鲁兰酶突变体PulBd‑117的基因的大肠杆菌摇瓶诱导发酵44h，即可使发酵液上清液中的胞外酶活达49.6U·mLsupgt;‑1/supgt;，是野生型的2.9倍。

技术领域

本发明涉及一种具有高分泌能力的普鲁兰酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。

背景技术

淀粉是植物体中贮存的养分，主要贮存在植物种子和块茎中，储量十分丰富。除食用外，淀粉主要被用于糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的制备，应用十分广泛。在利用淀粉制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的过程中，高效水解淀粉中存在的α-1,4-葡萄糖苷键以及α-1,6-葡萄糖苷键十分重要。其中，α-1,6葡萄糖苷键的含量虽然较低，只有6％左右，但是，α-1,6-葡萄糖苷键会使得淀粉形成分支结构，并且，大部分的如α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶等的淀粉加工用酶都是α-1,4-葡萄糖苷键水解酶，不具有α-1,6-糖苷键水解活力或水解活力极低，这大大降低了淀粉的利用率、增加了淀粉的转化时间，导致利用淀粉水解制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的生产效率低下。

普鲁兰酶，又名普鲁兰多糖-6-葡聚糖水解酶(pullulan-6-glucanohydrolase)，它可以专一性切割支链糊精中的α-1,6葡萄糖苷键，若在利用淀粉水解制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的过程中将普鲁兰酶与α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶等淀粉加工用酶联用，无疑可以大大提高淀粉的利用率，缩短淀粉的转化时间，为提高利用淀粉水解制备糊精、麦芽糖、葡萄糖、酒精等产品的生产效率提供更多可能。

但是，现有的普鲁兰酶仍然存在很多缺陷，其中，较为显著的缺陷是分泌能力差，例如，Ana Chen等人将来源于Bacillus acidopullulyticus的普鲁兰酶在大肠杆菌中表达后，发酵液中几乎检测不到任何胞外酶活(具体可见文献：Microb Cell Fact(2016)15:9)；Xuguo Duan等人将来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶在大肠杆菌中表达后，其胞外酶活只有11.6U·mL^-1，仅占总酶活的1.2％(具体可见文献：Bioresource Technology146(2013)379–385)；Xinye Wang等人将来源于Bacillus naganoensis的普鲁兰酶在大肠杆菌中表达后，其胞外酶活只占总酶活的34.4％(具体可见文献：Protein Expr Purif,2019,155:72-77.)，远远达不到工业生产的要求。

并且，普鲁兰酶胞外表达水平低的问题，会大大提高发酵生产发酵普鲁兰酶时后续产物分离提取的难度，进一步提高工业生产成本，阻碍了普鲁兰酶的进一步推广应用，因此，急需找到一种具有高分泌能力，尤其是高胞外分泌能力的普鲁兰酶，以提高普鲁兰酶的产量，同时，降低普鲁兰酶分离提取的难度。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是得到一种具有高分泌能力，尤其是高胞外分泌能力的普鲁兰酶。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种普鲁兰酶突变体，所述普鲁兰酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第306位和/或117位氨基酸进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶突变体是通过在出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶的第306位依次插入赖氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸以及天冬氨酸四个氨基酸残基得到的，命名为PulBd-306；