[发明专利]一种快速检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的引物及方法

说明书

本发明公开了一种快速检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的引物及方法，以GH63基因作为特异性分子标记，设计出扩增有害疣孢霉的特异性引物，通过PCR扩增的方法在病害还未发生之前快速检测双孢蘑菇覆土层中是否存在有害疣孢霉孢子，对于双孢蘑菇疣孢霉病害的防治有着积极的作用，也解决了传统方法时效性差的不足。

技术领域

本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测双孢蘑菇覆土中有害疣孢霉病病原菌的引物及方法。

背景技术

双孢蘑菇(Agaricus bisporus)是世界上广泛栽培的食用菌，但在生长过程中易发生双孢蘑菇疣孢霉病，常造成严重的经济损失，影响双孢蘑菇产业的经济效益。

双孢蘑菇疣孢霉病，是双孢蘑菇栽培过程中的重要病害，常影响着双孢蘑菇的产业，造成严重的经济损失，它的病原菌有害疣孢霉(Hypomyces perniciosus)是常见的土壤真菌，传播途径主要是通过厚垣孢子传播，而厚垣孢子主要存在于覆土中，它的适应能力很强，菇房周围的废弃物和土壤成了该病害的最初主要的侵染来源，有害疣孢霉的分生孢子、厚垣孢子及菌丝体都有致病的能力，并且覆土中病原孢子量也会影响疣孢霉病的发病率。

目前常用的双孢蘑菇有害疣孢霉病原菌的鉴定方法主要是通过采集双孢蘑菇覆土样品，进行微生物分离培养，之后通过不断地纯化，得到病原菌的纯培养物，再进行形态观察，并提取真菌DNA，进行ITS扩增，测序后对序列进行比对鉴定后判断其为有害疣孢霉，此方法往往费时费力，操作繁琐，程序复杂，得到结果的时候已经错过了最佳的防治时期，所以通过提取土壤中的真菌总DNA，利用有害疣孢霉的特异性分子标记，运用PCR技术(聚合酶链式反应)在病害还未发生之前来判断病原菌的有无至关重要，该方法简便省事，程序简单。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种基于PCR技术定性检测双孢蘑菇覆土中有害疣孢霉病原菌的引物及方法，所述方法可以快速检测到双孢蘑菇覆土材料中的有害疣孢霉孢子，在病害发生之前发现病害，提前进行防治，为双孢蘑菇疣孢霉病害的病害预警提供技术支持。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

根据GH63基因设计引物GH63-F(SEQ ID NO.1)和GH63-R(SEQ ID NO.2)，用作快速检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的引物。

一种检测覆土中双孢蘑菇疣孢霉病病原菌的方法，包括以下步骤：

(1)采集双孢蘑菇覆土，提取土壤总DNA；

(2)以土壤总DNA为模板，使用引物GH63-F(SEQ ID NO.1)和GH63-R(SEQ ID NO.2)进行PCR扩增；

(3)将扩增产物进行核酸电泳检测，如果土壤样品中检测到326bp的扩增条带，则说明覆土中存在有害疣孢霉病原真菌。优选地，上述检测方法步骤(1)中双孢蘑菇覆土在PDA液体培养基中扩大培养后再提取土壤总DNA。

优选地，上述检测方法中PCR程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃，10min，4℃保存。

相比于现有技术，本发明具有的有益效果如下：

1、本发明根据有害疣孢霉基因组的注释信息找到GH63基因序列，比较近缘物种的GH63同源基因，设计出扩增有害疣孢霉的特异性引物，应用该引物以双孢蘑菇覆土DNA为模板获得长度为326bp的有害疣孢霉特异性产物。

2、通过PCR扩增的方法快速检测双孢蘑菇覆土层中是否存在有害疣孢霉孢子，进行提前防治，对于双孢蘑菇疣孢霉病害的防治有着积极的作用，也解决了传统方法时效性差的不足。

附图说明