[发明专利]一种从人血液中分离抗体的混合模式层析方法

说明书

本发明公开了一种从人血液中分离抗体的混合模式层析方法。具体步骤如下：1)预处理，人血液样品，加抗凝剂，离心取上清液，得到血浆；2)层析分离，采用磺胺吡啶为配基的混合模式介质，固定床层析分离血浆，上样pH值6.0～9.0，稀释率0～3.0，洗脱pH值3.0～5.0，收集洗脱峰；3)脱盐和干燥，洗脱收集液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于95％的抗体。本发明的特色在于可以从人血液中直接分离得到高纯度的抗体，方法的关键在于采用了以磺胺吡啶为配基的混合模式层析介质，不用调整血液离子强度和pH条件下吸附抗体，弱酸性条件下洗脱，具有选择性强、洗脱条件温和、抗体收率和纯度高、工艺简单、成本低廉等特点。

技术领域

本发明属于蛋白质分离技术领域，涉及一种从人血液中分离抗体的混合模式层析方法。

背景技术

抗体是B淋巴细胞受外界抗原刺激产生的，能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)，主要来源于动物血液、初乳和蛋黄，其中血液中抗体含量高，来源丰富，是制备免疫球蛋白的主要原料。血液中免疫球蛋白的提取方法包括盐析法(如硫酸铵盐析法、多聚磷酸钠絮凝法)、有机溶剂沉淀法(如冷乙醇分级沉淀分离法)、聚合物沉淀法、变性沉淀法等，应用较多的为硫酸铵盐析法和冷乙醇沉淀法。但盐析法和有机溶剂沉淀法存在耗时、产品纯度和回收率较低等局限，开发新的免疫球蛋白提取工艺具有重要的应用价值。

混合模式层析是一种新型的生物分离技术，配基兼有多种功能基团，可以与目标蛋白产生多种相互作用，主要是疏水和静电相互作用。混合模式介质的配基密度通常较高，吸附容量大，具有耐盐吸附特性，洗脱条件温和，特别适合于大规模的分离纯化，已在抗体等蛋白的分离纯化中得到应用。自2011年Pezziniet等报道了混合模式层析(J.Chromatogr.A,2011,1218:216)，抗体分离技术不断得到改进。专利(US Patent 8,802,448；US Patent 7,691,980；US Patent 0,264,685)报道了混合模式层析在抗体分离中应用，混合模式介质可有效去除非抗体类蛋白、抗体聚集体和其它大分子杂质。专利(CN101899110B；CN101948535A；CN101402671B)报道了混合模式层析用于畜禽血液中免疫球蛋白的分离，具有步骤简单、分离效率高、成本低廉的特点。专利(CN107138139A)报道了一种用于清除血浆致病抗体的混合模式免疫吸附剂及其制备方法，作为自身免疫性疾病的治疗手段。Luo等(J.Chromatogr.A,2018,1533:77)采用填充有ABI-4FF和MMI-4FF介质的两步层析，分离血清中IgM，但是少量HSA也会结合到层析介质，影响分离抗体的纯度。Wang等(J.Chromatogr.B,2013,936:33)采用混合模式介质Bestarose Diamond MMA、BestaroseDiamond MMC、MEP HyperCel和PPA HyperCel介质从模拟血清中分离IgG，其中BestaroseDiamond MMA介质同时吸附IgG和HSA，吸附选择性差；Bestarose Diamond MMC和PPAHyperCel介质存在抗体洗脱困难，不利于实际分离应用；MEP HyperCel介质主要吸附IgG，但仍结合少量HSA，IgG的选择性一般。因此，研发新型混合模式层析介质，实现抗体的特异性结合，对于抗体的大规模分离纯化有着重要的意义。

针对抗体分离，建立了吡啶类、咪唑类、吲哚类和多芳香环类化合物的小分子混合模式配基库，进行了配基和IgG亲和性的高通量筛选，发现磺胺吡啶类化合物对IgG亲和性高、耐盐性强，而对HSA亲和性低，可作为血液抗体的分离配基。以亲水性多孔微球为基质，偶联磺胺吡啶为功能配基，介质结构见图1。本发明利用抗体和磺胺吡啶的高亲和性，选用以磺胺吡啶为主要功能配基的混合模式介质，直接从人血液样品中捕获抗体，开发了一种混合模式层析分离人免疫球蛋白的新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种从人血液中分离抗体的混合模式层析方法，具体包括如下步骤：

1)取含有免疫球蛋白的血液样品，通过离心取上清液，得到上样粗品溶液；