[发明专利]一种靶向心肌肌钙蛋白I的纳米人工抗体的制备方法与用途

说明书

本发明公开了一种靶向心肌肌钙蛋白I的纳米人工抗体的制备方法与用途，将多种功能单体和交联剂聚合形成凝胶纳米颗粒人工抗体，通过改变功能单体的配比来调控人工抗体对肌钙蛋白I的亲和力和选择性。结合分子印迹技术，以肌钙蛋白I的全蛋白或多肽片段为模板，进一步提高纳米人工抗体对肌钙蛋白I的特异性和选择性。筛选后纳米人工抗体对肌钙蛋白I的亲和力常数K_D值达到6.26×10^‑11M，与抗体相当，且具有良好的选择性。所得到的纳米人工抗体结合磁性纳米颗粒、整体柱或微流控芯片可实现血清样品中低丰度心肌肌钙蛋白I的高选择性富集，并可通过高灵敏度拉曼光谱、荧光定量检测、ELISA试剂盒、化学发光试剂盒、试纸条等方法实现肌钙蛋白I的高灵敏度检测。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种靶向心肌肌钙蛋白I的纳米人工抗体的制备方法与用途，所述非生物纳米人工抗体具有类似天然抗体和免疫抗体的高亲和力和高选择性，可用于替代天然抗体和免疫抗体。

背景技术

急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。中国近年来呈明显上升趋势，每年新发至少50万，现患至少200万。采用心肌钙蛋白I(cTnI)快速诊断试剂，可作为心肌梗死突发时的快速的辅助诊断，被越来越多的应用。

正常情况下外周血cTnI的水平很低：(0～0.3μg/L)，急性心肌梗死发作后，由于其分子量小，很快释放入血，浓度迅速升高。但由于血清样本成分复杂，目前真实样本中低丰度cTnI的检测依旧缺乏选择性和特异性。

天然抗体广泛应用于肌钙蛋白的选择性识别和检测，然而天然抗体主要由动物免疫获得，存在成本高，制备效率低、筛选周期长、易变性难保存、具有免疫原性等缺点，单克隆抗体也存在批次性能差异大的问题，在实际应用中具有很大的局限性。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种靶向心肌肌钙蛋白I的纳米人工抗体的制备方法与用途，通过模拟蛋白质-蛋白质相互作用，研究蛋白质-柔性聚合物相互作用，通过调整柔性聚合物的单体序列结构和空间分布，以创建具有蛋白质样高度特异性和可逆结合特性的基于纳米粒子的人工抗体。

技术方案如下：

一种靶向心肌肌钙蛋白I的纳米人工抗体的制备方法为：N-异丙基丙烯酰胺，N-叔丁基丙烯酰胺，十二烷基磺酸钠，带电功能单体，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂、心肌肌钙蛋白I全蛋白或心肌肌钙蛋白I的多肽片段作为模板分子，在引发剂作用下通过聚合后洗脱模板分子得到非生物纳米人工抗体。

所述的心肌肌钙蛋白I的多肽片段为N端多肽片段或C端多肽片段。

优选的，所述带电功能单体包括N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、1-乙烯基咪唑、N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基氯化铵、N-(2-氨基乙基)丙烯酰胺、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐中的任意一种或几种。

优选的，N-异丙基丙烯酰胺的用量为5-60wt％，N-叔丁基丙烯酰胺的用量为5-50wt％，带电功能单体的用量为0.5-20wt％，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的用量为0.5-10wt％。

优选的，聚合方法为反相乳液聚合、沉淀聚合或自由基聚合中的任一种。

优选的，引发剂为过硫酸铵或偶氮二异丁腈。

优选的，氮气氛围下的聚合反应温度为25-70℃，聚合反应时间为3-36h。

优选的，模板分子洗脱溶液为NaCl、柠檬酸钠、甘氨酸或十二烷基磺酸钠中的任意一种，或者通过改变温度和pH值实现模板分子的洗脱。