[发明专利]针对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf(BRAF)的SRM/MRM测定

说明书

本发明提供了来自丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B‑raf(BRAF)的具体的肽和这些肽的衍生电离特性，其特别有利于通过选择反应监测(SRM)质谱或也可称作多反应监测(MRM)质谱的方法直接定量已经在福尔马林中固定的生物样品中的BRAF蛋白质。这类生物样品是经化学保藏和固定的，该生物样品选自使用含有试剂/固定剂的甲醛处理的组织和细胞，包括福尔马林固定的组织/细胞、福尔马林固定/石蜡包埋(FFPE)的组织/细胞、FFPE组织块和来自那些块的细胞，以及经福尔马林固定和或石蜡包埋的组织培养细胞。使用Liquid Tissue试剂和方案从该生物样品中制备蛋白质样品并通过在蛋白质样品中定量至少一种或多种所描述的肽来使用SRM/MRM质谱的方法在Liquid Tissue样品中定量BRAF蛋白质。这些肽在其以修饰的或未修饰的形式存在时可被定量。BRAF肽的修饰的形式的一个示例是肽序列内酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸和/或其他氨基酸残基的磷酸化。

相关申请

本申请是申请号为201580035587.2、申请日为2015年07月13日、享有申请日为2014年07月11日的申请号为US62/023,615的美国在先申请优先权的，发明名称为“针对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf(BRAF)的SRM/MRM测定”的中国发明专利申请的分案申请。

引言

提供了来源于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf(其也称作原癌基因B-Raf、p94、v-Raf鼠肉瘤病毒癌基因同系物B1和BRAF，并在本文中称作“BRAF”)的亚序列的特定肽。各种肽的肽序列和碎片/过渡离子可用于基于质谱的选择性反应监测(SRM)测定中，其也称为多反应监测(MRM)测定，且在本文中称作SRM/MRM。描述了用于BRAF蛋白质的SRM/MRM定量分析的肽的用途。

可使用该SRM/MRM测定来测量来自BRAF蛋白质的一种或多种特异性肽的相对或绝对定量水平，并由此提供通过质谱测量在从生物样品中获得的给定蛋白质制备物中BRAF蛋白质的总量的方法。

更具体地，该SRM/MRM测定可直接测量由从诸如福尔马林固定的癌症患者组织的患者组织样品取得的细胞制备的复杂蛋白质裂解物样品中的那些肽。由福尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述在美国专利第7,473,532号中，其内容通过引用全文纳入本文。该专利描述的方法可使用获自表达病理学公司(ExpressionPathologyInc.)(马里兰州罗克维尔)的试剂和方案方便地进行。

可最广泛且有利地获得的来自癌症患者组织的组织形式是福尔马林固定、石蜡包埋的组织。对手术移出的组织进行甲醛/福尔马林固定是迄今为止世界范围内最常见的保存癌症组织样品的方法且是标准病理学实践中已经接受的常规方法。甲醛水溶液被称作福尔马林。“100％”福尔马林由甲醛在水中的饱和溶液(约40体积％或37重量％)组成，其含有少量用于限制氧化和聚合程度的稳定剂，通常为甲醇。保藏组织的最常用方式是将整个组织在通常称为10％中性缓冲福尔马林的甲醛水溶液中长时间(8小时至48小时)浸泡，接着在室溫下将固定的整个组织包埋在石蜡中以便长期储存。因此，分析福尔马林固定的癌症组织的分子分析方法将是用于分析癌症患者组织的最被接受且大量利用的方法。

SRM/MRM测定的结果可用于关联自其中收集并保藏组织(生物样品)的患者或受试者的具体组织样品(例如癌症组织样品)内BRAF蛋白质的准确且精确的定量水平。这不仅提供关于癌症的诊断和预后信息，而且容许医师或其它医疗专业人员更精确地确定用于患者的适当疗法。提供关于患病组织或其他患者样品中蛋白质表达水平的诊断、预后和治疗重要信息的这一测定称为伴随诊断测定。例如，这一测定可设计用于诊断癌症的阶段或程度并确定患者最可能应答的治疗剂。

发明内容

本发明所述的测定测量来自BRAF蛋白质的特定未修饰的肽的相对或绝对水平并且可测量来自BRAF蛋白质的特定修饰的肽的绝对或相对水平。修饰的示例包括可能在这些肽上存在的磷酸化氨基酸残基和糖基化氨基酸残基。