[发明专利]外源基因定点整合至ACTB基因下游的打靶载体构建方法及其应用

权利要求书

1.一种将外源基因定点整合至猪ACTB基因下游的打靶载体，其特征在于，以猪ACTB基因终止密码子上下游序列作为左、右同源臂，将左同源臂、2A剪切肽序列、外源基因序列和右同源臂依次连接起来并构建到真核表达载体或克隆载体骨架上，所述的左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，右同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，2A序列如SEQ IDNO.3所示。

2.如权利要求1所述打靶载体，其特征在于：所述真核表达载体为pCDNA3.1(+)，插入的多克隆位点位于Hind III与Kpn1位点之间。

3.权利要求1或2所述的打靶载体在将外源基因定点整合至猪ACTB基因下游中的应用。

4.特异性靶向猪ACTB基因下游的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQ IDNO.5所示。

5.利用CRISPR/Cas9系统将外源基因定点整合至猪ACTB基因下游的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建打靶载体：以ACTB基因终止密码子上下游序列作为左、右同源臂，将左同源臂、2A剪切肽序列、外源基因序列和右同源臂依次连接起来，反向插入到真核表达载体的多克隆位点上；所述左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，右同源臂的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，2A剪切肽序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)构建CRISPR-Cas9切割载体：所述的切割载体含特异性靶向猪ACTB基因下游的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(3)将所述打靶载体和CRISPR-cas9切割载体共同转染猪真核细胞。