[发明专利]外源基因定点整合至ACTB基因下游的打靶载体构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种将外源基因定点整合至ACTB（beta‑actin）基因下游的打靶载体，所述的打靶载体是以ACTB基因终止密码子上下游的部分序列为左、右同源臂，将左同源臂、2A剪切肽序列、外源基因序列和右同源臂依次连接起来并构建到真核表达载体或克隆载体骨架上。将该打靶载体与含特异性靶向猪ACTB基因下游的CRISPR/Cas9切割载体共转染至猪真核细胞中，实验及测序检测证实该外源基因定点整合至ACTB基因下游。本发明提供的这一打靶位点，可以拓宽外源基因在猪基因组中整合位点的范围，为制备外源基因高效稳定表达的转基因猪奠定基础。

技术领域

本发明属于动物基因编辑工程领域，具体地说，涉及一种将外源基因定点整合至猪ACTB基因下游的打靶载体及其构建方法和应用。

背景技术

在动物转基因工程研究领域，敲入的外源基因能在细胞或生物体内稳定并高效地表达是研究基因功能或者制备转基因动物的关键因素。外源基因随机整合至基因组会受到表观遗传、位置效应等各种因素的调控，所以外源基因的表达会呈现不稳定且效率难以保证。但如果通过基因编辑工具将外源基因定点整合至特异的基因组位点，并使其稳定高效表达，就不会受到其他因素的影响。所以，定点敲入外源基因至特定基因组位点具有重要意义。

ACTB(beta-actin)是一种细胞质肌动蛋白，也是细胞骨架的关键组成部分，在绝大多数非肌肉细胞以及未分化的成肌细胞中高效表达。与此同时，几乎参与真核细胞中所有的生理过程，包括细胞分裂及分化、细胞器及染色体运动、维持细胞骨架完整等等。此外，ACTB由于其具有高表达量、表达稳定的特点，因此常被作为内参基因。ACTB基因又在所有细胞中均稳定表达，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，又被称为持家基因(house-keeping genes)。综上，考虑到ACTB基因的高效且稳定表达，ACTB基因可以作为一个友好安全位点被加以利用，从而更好地推进动物基因工程领域的研究。

CRISPR-Cas9系统是近年来最为火热的基因编辑技术，它是广泛存在于细菌和古细菌中的获得性免疫系统，能主动切割外源基因组序列，从而抵御病毒对细菌的入侵。在单链指导RNA(sgRNA)的指引下，CRISPR-Cas9系统能特异性地定点编辑基因组序列，并且由于其简单实用、效率高效的特点而在生命科学领域被广泛应用。CRISPR-Cas9系统主要通过使DNA双链发生断裂，再通过DNA的损伤修复机制即非同源末端连接进行修复，但这种修复机制往往会导致碱基插入缺失。与此同时，此系统还可以与同源重组载体共同作用，从而进行同源重组修复，使基因组序列得到精确修饰，达到精准编辑的目的，利用这个原理，就可以定点敲入外源基因至基因组特定位点，并使其稳定高效表达，本发明就是在此基础上所做的研究。总而言之，CRISPR-Cas9系统在基因编辑领域具有巨大的发展和应用潜力，并且逐渐成为基因编辑领域最主流的编辑工具。

目前鲜有报道可用于猪外源基因定点敲入的安全位点，借助内参基因启动子从而稳定高效地表达外源基因的研究进展也不多。本发明借助了内参基因ACTB启动子，定点敲入外源基因并使其稳定高效表达，同时提供了一个可供外源基因定点敲入的安全友好位点。

发明内容

本发明的目的是提供了一种将外源基因定点敲入至ACTB基因下游的打靶载体及其应用，具体地说，即通过CRISPR-Cas9系统，所述打靶载体可将外源基因序列定点整合至ACTB基因下游，并且在ACTB基因启动子的驱动下，外源基因可以稳定高效表达。

本发明采用以下技术方案：

一种将外源基因定点整合至猪ACTB基因下游的打靶载体，其构建方法是：

以猪ACTB基因终止密码子上下游序列作为左、右同源臂，将左同源臂、2A剪切肽序列、外源基因序列和右同源臂依次连接起来并构建到真核表达载体或克隆载体骨架上，所述的左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，右同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，2A序列如SEQ ID NO.3所示。