[发明专利]貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种貉细小病毒性肠炎、犬瘟热二联灭活疫苗，其特征在于该疫苗的有效成分为重组杆状病毒RDPV-SN1株表达的貉细小病毒VP2蛋白、犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原、氢氧化铝胶佐剂；

所述该疫苗用于预防犬瘟热和貉细小病毒性肠炎；

所述的貉细小病毒VP2蛋白是由表达貉细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒RDPV-SN1株转染Sf9细胞，培养至细胞出现感染获得，该株病毒被命名为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒重组杆状病毒RDPV-SN1株，已于2019年05月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.17685；

所述犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原是由犬瘟热病毒CDV-11株经BEI灭活后获得，该毒株已于2009年07月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 3201；

表达貉细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒RDPV-SN1株的构建包含如下步骤：

（1）转移载体的构建：在pVL1393载体上添加蜂毒素信号肽HBM以及β-肌动蛋白绝缘子HS4序列，构建转移载体pVL-HBM-HS4；

（2）重组转移载体的构建：提取貉细小病毒RDPV-SN1株VP2基因，将提取的VP2基因克隆至转移载体pVL-HBM-HS4中，获得重组转移载体pVL-HBM-HS4-VP2，所述VP2基因序列如SEQID No:3所示；

（3）重组杆状病毒RDPV-SN1株的构建：将重组转移载体pVL-HBM-HS4-VP2与线性化苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV基因组DNA共转染Sf9细胞，获得表达貉细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒，命名为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒重组杆状病毒RDPV-SN1株；

该疫苗的制备方法包括以下步骤：

（1）制备貉细小病毒VP2蛋白：选择生长旺盛的Sf9细胞接种细胞培养罐进行全悬浮培养，接种密度为1.5×10⁶～2.0×10⁶个细胞/ml，27℃培养。当细胞培养罐中Sf9细胞密度达到1.5×10⁶～3.0×10⁶个细胞/ml时，按MOI=0.2～2.0接种重组杆状病毒RDPV-SN1株，27℃培养72～96h，收获细胞培养物，向其中加入2% BEI溶液，使BEI终浓度为0.1%，混匀后37℃灭活48h，对1%猪红细胞血凝效价≥1:2048，然后向细胞培养物中添加50%的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2%，搅拌1h后终止灭活；经无菌和灭活检验合格后，即得貉细小病毒VP2蛋白；

（2）制备犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原：选择生长旺盛的Vero细胞接种细胞培养罐进行微载体悬浮培养，当细胞培养罐中Vero细胞密度达到2.0×10⁶～2.5×10⁶个细胞/ml时，按MOI=0.1接种CDV-11株犬瘟热病毒，待微载体表面80%细胞变圆突起且有少量脱落时，快速搅拌10～15min，用75μm滤板滤除微载体，收获病毒液，用20μm和5μm滤芯去除细胞碎片，收获细胞培养物，犬瘟热病毒含量应不低于10^7.5TCID₅₀/ml；向收获的细胞培养物中加入2%BEI溶液，使BEI终浓度为0.1%，混匀后37℃灭活48h，然后向细胞培养物中添加50%的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为0.2%，搅拌1h后终止灭活；经无菌和灭活检验合格后，即得犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原；

（3）将步骤（1）获得的貉细小病毒VP2蛋白稀释至对1%猪红细胞血凝效价不低于1:256，与步骤（2）获得的犬瘟热病毒CDV-11株灭活抗原按适当比例混合均匀，与灭菌的氢氧化铝胶按9:1的比例进行配苗，再加入1% 硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%，充分搅拌后即成。