[发明专利]鉴定苜蓿种子真伪的特异分子标记及其应用

权利要求书

1.分子标记在鉴定苜蓿种子中的应用，其特征在于，所述苜蓿种子选自金花菜和紫花苜蓿中的至少一种，所述分子标记包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

2.一种用于鉴定苜蓿种子的引物对，其特征在于，所述苜蓿种子选自金花菜和紫花苜蓿中的至少一种，所述引物对能够扩增如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的用于鉴定苜蓿种子的引物对，其特征在于，所述引物对包括如SEQ ID No.3所示的上游引物和如SEQ ID No.4所示的下游引物。

4.一种鉴定苜蓿种子的方法，其特征在于，所述苜蓿种子选自金花菜和紫花苜蓿中的至少一种，所述方法包括：采用如权利要求2或3所述的引物对，以被检测种子基因组DNA为模板进行扩增，扩增产物在150bp～200bp时判定所述被检测种子为苜蓿种子。

5.根据权利要求4所述的鉴定苜蓿种子的方法，其特征在于，在扩增之前还包括：对被检测种子的外部形态特征进行鉴定。

6.根据权利要求5所述的鉴定苜蓿种子的方法，其特征在于，在被检测种子的外部形态特征符合苜蓿种子的外部形态特征后进行所述扩增。

7.根据权利要求4所述的鉴定苜蓿种子的方法，其特征在于，扩增产物小于165bp时，判定所述被检测种子为紫花苜蓿；扩增产物大于165bp时判定所述检测种子为金花菜。

8.根据权利要求7所述的鉴定苜蓿种子的方法，其特征在于，当扩增产物的大小为173bp时判定所述被检测种子为金花菜种子；扩增产物的大小为159bp时判定所述被检测种子为紫花苜蓿种子。

9.根据权利要求4～8任一项所述的鉴定苜蓿种子的方法，其特征在于，所述扩增为PCR扩增，所述PCR的反应体系为：

所述上游引物8～12pmol/μL 0.8～1.2μL，所述下游引物8～12pmol/μL0.8～1.2μL，dNTP 2.3～2.7mmol/L 3.0～5.0μL，DNA模板48～52ng/μL 0.8～1.2μL，Taq DNA聚合酶4.5～5.5U/μL 0.1～0.3μL，2×PCR缓冲液8～11μL，ddH₂O6～8μL。

10.根据权利要求9所述的鉴定苜蓿种子的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：93℃～95℃预变性3～5min，93℃～95℃变性28～32s；58℃～62℃退火28～32s；70℃～74℃延伸58～62s；扩增29～31个循环，最后70～74℃终延伸10min。

11.根据权利要求4～8任一项所述的鉴定苜蓿种子的方法，其特征在于，所述方法包括采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对所述扩增产物进行检测。

12.根据权利要求11所述的鉴定苜蓿种子的方法，其特征在于，所述电泳检测时，电泳槽电压为190～210V。

13.根据权利要求12所述的鉴定苜蓿种子的方法，其特征在于，所述电泳检测时，跑胶时间为150～170min。

14.根据权利要求4～8任一项所述的鉴定苜蓿种子的方法，其特征在于，所述被检测种子基因组DNA的获取方法包括：将收集的被检测种子在20℃～30℃萌发70～74h，提取被检测种子的基因组DNA。

15.一种用于鉴定苜蓿种子的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求2或3所述的用于鉴定苜蓿种子的引物对。

16.一种区分金花菜和紫花苜蓿的方法，其特征在于，其包括：采用如权利要求2或3所述的引物对，以被检测种子基因组DNA为模板进行扩增，扩增产物小于165bp时判定所述检测种子为紫花苜蓿；扩增产物大于165bp时判定所述检测种子为金花菜。