[发明专利]一种小分子探针及其制备与应用

说明书

本发明公开了一种光控靶向线粒体的小分子探针及其制备方法与应用，小分子探针含有线粒体定位基团、光控触发基团和正交基团三种修饰，合成过程简单，应用更高效、快捷。它们可以精准地定位到线粒体并在其内部聚集，光触发条件下，探针与线粒体蛋白质选择性地反应标记形成探针‑蛋白复合物，再通过正交反应检测被标记蛋白。本发明减少了传统提取线粒体蛋白的繁琐过程，通过直接破碎HeLa细胞样品提取了高纯度的线粒体活性蛋白，为进一步完善线粒体蛋白质组谱提供一种新的策略。HeLa细胞成像验证了甲基苯醌探针具有高效靶向线粒体能力；线粒体蛋白标记实验表明了探针具有良好的标记能力。

技术领域

本发明涉及化学和生物技术领域，具体地说，是一种光控靶向细胞线粒体的甲基苯醌小分子探针及其制备与应用。

背景技术

线粒体是真核细胞中重要的细胞器，普遍存在于有氧呼吸的真核细胞的细胞质中。线粒体参与重要的细胞生理过程如：三羧酸循环、脂肪酸和氨基酸氧化、调控ATP的合成、离子稳态调节等，在细胞能量代谢、生物合成和细胞凋亡等调控中起着关键作用。线粒体功能异常与许多人类疾病(如糖尿病、癌症、神经退行性疾病等)相关，因此线粒体在维持生命稳态起到重要作用，深入研究线粒体蛋白功能，将为疾病治疗提供新策略。

传统研究线粒体蛋白方法是差速离心结合密度梯度离心，但该方法存在缺陷：比如操作复杂、所用仪器要求严格、线粒体易破碎损失、细胞器粘连导致纯度污染、样品需求量大、难以特异地检测线粒体各个亚区间(基质、膜间隙)的蛋白质等，这些缺点严重制约了该技术的实用化。近年来，化学生物学与线粒体蛋白质组的不断结合提供了新的思路，如活性蛋白表达谱技术，活性小分子探针与活性蛋白结合，进而富集、质谱鉴定研究其靶标蛋白的功能。

本发明为了开发一种能减少分离步骤，利用可控方式靶向线粒体蛋白质，设计并合成了一类能够靶向活细胞线粒体蛋白的光触发小分子活性探针。该类探针由三部分构成：线粒体定位基团(三苯基膦)、光触发基团(2-硝基苄基)及正交基团(炔基)。此类探针可简化分离纯化线粒体步骤，也可以运用在活性样品中，能够应用于化学反应染色线粒体及提取线粒体蛋白质组等。

发明内容

本发明目的是提供一种光控靶向线粒体的小分子探针及其制备方法与应用，可利用紫外光触发释放甲基苯醌活性物质，并结合线粒体蛋白，可减免细胞器分离纯化步骤，直接快速提取线粒体蛋白。

本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种式(I)所示紫外光可控靶向线粒体的小分子探针，

第二方面，本发明提供一种式(I)所示小分子探针的制备方法，具体如下：

1、本发明所述制备式(I)所示小分子探针的反应路线如下：

(A)定位基团的合成

(B)甲基苯醌探针(I)合成

2、本发明所述式(I)所示小分子探针的制备方法，按照如下步骤进行：

(1)将三苯基膦、3-溴丙胺氢溴酸盐溶于乙腈中，加热回流12小时，反应结束后，冷却至室温，离心，取固体溶于异丙醇和乙醚中重结晶，晶体干燥后得到白色固体产物，即为式(1-1)所示化合物；

(2)将对羟基扁桃酸溶于无水二甲基甲酰胺，缓慢加入炔丙胺，1-羟基苯并三唑，冰浴搅拌(优选0℃搅拌10min)，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N，N-二异丙基乙胺，冰浴15min后，在氮气保护下室温反应16小时，反应液用乙酸乙酯萃取，有机相水洗三次，饱和食盐水洗涤一次后，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，以体积比10:1的二氯甲烷/甲醇为展开剂进行硅胶薄层层析，收集R_f值为0.4的产物，干燥，得到式(1-2)所示化合物；