[发明专利]一种解酯耶氏酵母YW100-1及其应用

权利要求书

1.一种产丙酮酸的解酯耶氏酵母（Yarrowialipolytica）YW100-1基因工程菌，其特征在于所述解酯耶氏酵母（Yarrowialipolytica）YW100-1是在野生型解酯耶氏酵母中过表达甘油代谢中甘油激酶GUT1，甘油激酶GUT2，甘油脱氢酶GCY1，二羟基丙酮激酶DAK1，二羟基丙酮激酶DAK2和NADH激酶POS5，同时敲除解酯耶氏酵母中二酰基甘油酰基转移酶基因DGA2和3-磷酸甘油脱氢酶基因GPD2获得的；所述甘油激酶GUT1基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，甘油激酶GUT2基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，二羟基丙酮激酶DAK1基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，二羟基丙酮激酶DAK2基因核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，甘油脱氢酶GCY1基因核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，NADH激酶POS5基因核苷酸序列为SEQ IDNO.6所示；二酰基甘油酰基转移酶5’DGA2基因核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示，二酰基甘油酰基转移酶3’DGA2基因核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示；3-磷酸甘油脱氢酶5’GPD2基因核苷酸序列为SEQ ID NO.15所示，3’GPD2基因核苷酸序列为SEQ ID NO.16所示。

2.如权利要求1所述解酯耶氏酵母YW100-1，其特征在于所述解酯耶氏酵母YW100-1按如下方法构建：

（1）将来源于解酯耶氏酵母的GUT1基因、GUT2基因，以及启动子pEXP1片段，通过重叠延伸获得GUT1-pEXP1-GUT2，连接到载体JMP113上，得到载体E14；

（2）将构建的载体E14用Not I酶切，转入到野生型解酯耶氏酵母GIM2.187中，得到转化后的解酯耶氏酵母工程菌ZS102；

（3）将来源于解酯耶氏酵母的GCY1，DAK1，DAK2基因，启动子pTEF，pEXP1，pGPD，以及用于整合的同源臂KU70的5’端和3’端，通过重叠延伸分别获得5’KU70-URA3-pTEF-DAK1，DAK1-pEXP1-DAK2-pGPD，pGPD-GYC1-3’KU70三个大片段，转入到ZS102中，得到转化后的解酯耶氏酵母工程菌ZS104；

（4）将来源于解酯耶氏酵母的POS5基因以及pTEF，以及用于敲除GPD2的5’端GPD2和3’端GPD2，通过重叠延伸获得5’GPD2-URA3-pTEF-POS5和POS5-3’GPD2二个片段，转入到ZS104中，得到同源重组后的解酯耶氏酵母工程菌ZS106；

（5）将用于敲除的5’端和3’端DGA2，通过重叠延伸获得5’DGA2-URA3-DGA2片段，转入到ZS106中，得到解酯耶氏酵母YW100-1。