[发明专利]一种解酯耶氏酵母YW100-1及其应用

说明书

本发明公开了一种解酯耶氏酵母YW100‑1及其应用，所述解酯耶氏酵母YW100‑1是在解酯耶氏酵母中过表达甘油代谢中甘油激酶GUT1，甘油激酶GUT2，甘油脱氢酶酶GCY1，二羟基丙酮激酶DAK1，二羟基丙酮激酶DAK2和NADH激酶POS5，同时敲除解酯耶氏酵母中二酰基甘油酰基转移酶基因DGA2和3‑磷酸甘油脱氢酶基因GPD2获得的。本发明菌株以甘油为碳源时，丙酮酸产量增加了66.2％，达到121.2g/L，为丙酮酸工业化生产提供了优良菌株。

(一)技术领域

本发明涉及一种解酯耶氏酵母工程菌的构建方法和应用，属生物工程技术领域。

(二)背景技术

丙酮酸作为微生物代谢途径中的中间体，也是重要的有机酸之一，在生物化工，制药，食品以及科学领域中具有广泛的作用。在医药工业，丙酮酸是一种重要的医药中间体，可用于合成左旋多巴，消炎镇痛药辛可芬，抗结核药异烟肼丙酮酸钙，噻咪唑药物等，此外，丙酮酸盐类(如丙酮酸钙，丙酮酸钾，丙酮酸肌酸盐等)广泛应用于减肥保健品药类。在食品行业，丙酮酸作为食品添加剂，具有天然的防腐和保鲜功效。在化工行业，丙酮酸乙酯作为皮肤美白剂，可以抑制皮肤中的黑色素的形成，具有很好的皮肤美白功效。此外，丙酮酸作为新一代的生物燃料的前体，国内外市场需求迅速增长，具有广阔的应用价值。

目前丙酮酸生产的方法主要有化学合成法，酶转化法，微生物发酵法三大类。化学合成法主要是以酒石酸为原料，化学合成丙酮酸，但该方法污染重，成本高，工业化生产受到了限制。酶转化法主要是利用微生物中的脱氢酶系，将乳酸转化为丙酮酸，但是该方法转化率低，成本高，目前还没有实现工业化生产。微生物发酵法主要是利用微生物，以葡萄糖或者甘油等廉价为碳源，通过微生物发酵，直接生产丙酮酸。目前微生物发酵法使用的菌株有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，大肠杆菌(Escherichia coli)，光滑球拟酵(Torulopsis glabrata)，解酯耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等。与化学合成法和酶转化法相比，具有污染小，转化率高，成本低等优点，也是目前工业化的主要方法。

尽管解酯耶氏酵母具有较好的丙酮酸生产能力，但是其利用甘油合成丙酮酸的转化率以及合成速率仍有待提高，丙酮酸降解速度偏快导致无法大量积累。解酯耶氏酵母中存在两条甘油分解代谢途径，一条是甘油-3-磷酸途径，在细胞质中甘油在甘油激酶(由GUT1编码)的作用下磷酸化为甘油-3-磷酸，随后穿梭进入线粒体，在甘油-3-磷酸脱氢酶(由GUT2编码)的作用下氧化甘油-3-磷酸为磷酸二羟基丙酮，随后磷酸二羟基丙酮又被运回细胞质进入糖酵解代谢途径。另一条是二羟基丙酮(DHA)途径，在此途径中甘油脱氢酶(由GCY1编码)将甘油氧化为DHA，随后在二羟基丙酮激酶(由DAK1和DAK2编码)的作用下磷酸化为磷酸二羟基丙酮进入糖酵解代谢途径。解酯耶氏酵母作为一种高产油脂酵母，二酰基甘油酰基转移酶(由DGA2编码)可以利用磷酸二羟基丙酮合成油脂的重要组成部分三酰甘油。甘油的合成先经磷酸二羟丙酮，转化为3-磷酸甘油，随后经3-磷酸甘油脱氢酶(由GPD1，GPD2编码)，合成甘油。有研究表明，GPD2的敲除会使得胞内NADH的积累，从而打破NADH/NADPH平衡影响菌体的生长，而Pos5作为一种NADH激酶，可以利用ATP将NADH磷酸化为NADPH。

鉴于此，本发明将通过增强甘油-3-磷酸途径和二羟基丙酮途径来强化甘油的分解代谢途径来加速甘油的分解，同时减弱甘油的合成途，从而实现丙酮酸在细胞内的大量积累。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种高产丙酮酸的解酯耶氏酵母工程菌，及其构建与应用，为丙酮酸的工业化生产提供优良菌种。

本发明采用的技术方案是：