[发明专利]两步法筛选柑橘黄龙病生防菌的方法

权利要求书

1.两步法筛选柑橘黄龙病生防菌的方法，其特征在于：

（1）生防细菌对指示病原菌拮抗活性的检测：以柑橘溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv. citri)、软腐细菌(Erwinia carotovora subsp. carotovora Dye)、烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum )、西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）和克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae )为五种指示病原菌，将从柑橘黄龙病发病田中的健株和病株分离的生防内生细菌分别与前述五种指示病原菌做对峙培养，测量并记录抑菌圈的大小，没有抑菌活性为0分，抑菌圈大小为0.1～1.0cm为1分, 抑菌圈1.1～2.0cm为2分，抑菌圈2.1～3.0cm为3分，抑菌圈3.1～4.0cm为4分，每个生防内生细菌的赋值总分为对应的各个病原菌赋值分相加，选取赋值最高的生防内生细菌为潜力生防菌，所述健株和病株采用常规的实时荧光定量PCR检测柑橘黄龙病病原菌的方法确定；

所述常规的实时荧光定量PCR检测柑橘黄龙病病原菌的方法：所用的引物为上游引物CQULA04F和下游引物CQULA04R，所述上游引物CQULA04F的碱基序列如SEQ ID NO：1 所示，所述下游引物CQULA04R的碱基序列如SEQ ID NO：2 所示；实时荧光定量PCR反应体系为：TBGreen Premix ExTaq 12.5μL，上游引物CQULA04F 0.8μL，下游引物CQULA04R 0.8μL，ddH₂O5.9μL，模板DNA 5.0μL；实时荧光定量PCR反应条件：预变性95℃1分钟、变性95℃15秒、退火59℃15秒，45个循环，延伸72℃45秒；

（2）半叶法评价潜力生防菌对柑橘黄龙病的防效：将采集的每片柑橘黄龙病寄主病叶，从叶片中间横刀剪断分成两半，取其中半叶片的叶中脉用与步骤（1）中相同的实时荧光定量PCR检测柑橘黄龙病病原菌的方法检测其柑橘黄龙病病原菌含量作为处理组试验前柑橘黄龙病菌含量，用添加有吐温-20的潜力生防菌菌悬液喷洒处理每片叶片剩余的一半叶片，处理后的一半叶片用与步骤（1）中相同的实时荧光定量PCR检测柑橘黄龙病病原菌的方法检测其柑橘黄龙病病原菌含量作为处理组试验后柑橘黄龙病菌含量，通过以下公式计算潜力生防菌对柑橘黄龙病的防效，筛选防效高的潜力生防菌为柑橘黄龙病生防菌；所述的柑橘黄龙病寄主病叶采用与步骤（1）中相同的实时荧光定量PCR检测柑橘黄龙病病原菌的方法检测确定是否为柑橘黄龙病寄主病叶；

处理组柑橘黄龙病菌下降率（%）=［处理组试验前柑橘黄龙病菌含量-处理组试验后柑橘黄龙病菌含量］×100/处理组试验前柑橘黄龙病菌含量；

校正防效（%）=［处理组柑橘黄龙病菌下降率- 对照组柑橘黄龙病菌下降率］×100/［100-对照组柑橘黄龙病菌下降率］。

2.根据权利要求1所述的两步法筛选柑橘黄龙病生防菌的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的健株和病株以及步骤（2）中所述的寄主选自宽皮橘、杂柑、柑、葡萄柚、甜橙、椽、柚、柠檬、酸橙、金桔。