[发明专利]两步法筛选柑橘黄龙病生防菌的方法

说明书

本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及两步法筛选柑橘黄龙病生防菌的方法。本发明方法采用五种指示病原菌做对峙培养，筛选潜力生防菌，采用半叶法，用实时荧光定量PCR检测未经处理的半叶的柑橘黄龙病病原菌含量，另一半叶用潜力生防菌液处理后用实时荧光定量PCR检测其柑橘黄龙病病原菌含量，通过计算公式得到潜力生防菌的防效，筛选防效高的潜力生防菌为目标柑橘黄龙病生防菌。本发明方法可用于柑橘黄龙病的各种寄主、具有高效、快速等特点，对于柑橘黄龙病的生物防治具有重要意义。

技术领域

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，具体涉及柑橘黄龙病生防细菌的筛选。

背景技术

柑橘黄龙病(Huanglongbing，HLB)是一种世界性细菌病害，已在40多个国家有发生。它主要由柑橘木虱和嫁接传播，柑橘类所有的植物几乎都可以感染黄龙病。柑橘黄龙病一旦发病，对果实的品质和产量影响很大，会造成严重的经济损失。例如，美国佛罗里达州自2005年首次发现柑橘黄龙病以来，黄龙病已造成该州45多亿美元的损失。近些年来，我国的柑橘产业也面临因黄龙病带来的巨大损失和严峻挑战。

由于柑橘黄龙病的病原无法离体培养，未能完成柯赫氏法则，但植物病理学家依据病菌的来源地、致病能力和基因组信息，将黄龙病菌暂定为细菌韧皮部杆菌属下4个亚种，即亚洲亚种(Candidatus Liberibacter asiaticus)、非洲亚种(CandidatusLiberibacterafricanus)、美洲亚种(Candidatus Liberibacter americanus)和2015年报导的加勒比亚种(Candidatus Liberibacter caribbeanus)。4个亚种中，亚洲亚种分布最广，是对世界柑橘产业造成最大威胁的亚种。我国主要分布的也为亚洲亚种。检测其病原的方法主要为普通PCR和实时荧光定量PCR。黄龙病叶片的典型症状与缺素症相似，表现为斑驳黄化。

黄龙病病原菌在寄主植物中的时间分布和空间分布都不均匀。在中国，10-12月黄龙病病原菌含量最高，3-5月份最低；黄龙病病原菌在寄主植物中的空间分布为：种皮叶片中脉≈枝条果柄≈桔络叶肉果皮≈果肉主干。叶片之间病原菌含量也有差异，再加之病原菌不能培养和叶片典型症状与缺素症很接近，常规筛选生防菌的方法难以有效地实施，因此，给筛选和评价生防菌的防效带来了巨大困难。

因为缺乏有效的化学防治药剂和抗病品种，黄龙病的防控目前仍是世界难题。柑橘黄龙病的综合管理策略主要包括以下内容：1、铲除并销毁染病柑橘树；2、化学药剂控制传病介体—木虱的群体数量；3、培育无病种苗，严格检疫；4、加强营养管理；5、移栽无病大苗；6、网棚防虫栽培。生物防治是一种绿色、安全和可持续发展的病害防治手段，也符合我国“双减”政策的内涵。因此柑生物防治对于柑橘黄龙病控制有重要意义。

发明内容

为解决柑橘黄龙病的病原无法离体培养，无法采用常规生防菌筛选方法筛选其生防菌的技术难题，本发明提供一种两步法筛选柑橘黄龙病生防菌的方法，该方法包括以下步骤：

(1)生防细菌对指示病原菌拮抗活性的检测：以柑橘溃疡病菌(Xanthomonasaxonopodis pv.citri)、软腐细菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora Dye)、烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)和克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)为五种指示病原菌，将从柑橘黄龙病发病田中的健株和病株分离的生防内生细菌分别与前述五种指示病原菌做对峙培养，选取赋值最高的生防内生细菌为潜力生防菌，所述健株和病株采用常规的实时荧光定量PCR检测柑橘黄龙病病原菌的方法确定；