[发明专利]基于DIA技术挖掘性成熟前后藏绵羊睾丸差异蛋白质的方法

权利要求书

1.一种基于DIA技术挖掘性成熟前后藏绵羊睾丸差异蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A、组织收集

羊屠宰后，取出睾丸组织，用PBS清洗外部血渍并剥除白膜后，将其剪成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小组织快，迅速冻存于液氮中用于蛋白样本的制备；

步骤B、蛋白样本制备

向睾丸组织中加入裂解液，超声裂解；4℃，14000rpm条件下离心25-35min后，吸取上清液，用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度；取50μg蛋白质稀释至50 μL，随后加入1M DTT 1μL，在55℃孵育50-75min；加入1M碘乙酰胺IAA5μL，室温避光50-75min；加入300μL预冷的丙酮沉淀105-140min，沉淀用胰蛋白酶酶解过夜；

步骤C、建立谱图数据库

将所有酶解后的肽段混合物溶解于缓冲液甲中，缓冲液甲为20mM甲酸铵水溶液，pH=10.0， 用Ultimate 3000系统连接反向柱进行高pH反向分离，分离使用线性梯度，40min 内5% 溶液乙至45% 溶液乙；柱子在初始条件下平衡15min，柱流速维持在1mL/min，柱温维持在30℃；收集到6个部分，各个部分在真空浓缩仪中干燥；将除盐冻干后的肽段重溶于溶液丙中，后经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析；整套系统为串联EASY-nLC 1200系统的轨道阱质谱仪；总共上样3μL，以120 min梯度分离：5%溶液丁至35%溶液丁；柱流量控制在200 nL/min，电喷雾电压2 kV；

轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，自动在MS和MS/MS采集间切换；质谱参数设置如下：(1) MS：扫描范围m/z：350–1500；分辨率：120,000；AGC target：4e5；最大注入时间：50 ms；动态排除时间：30 s； (2)HCD-MS/MS：分辨率：15,000；AGC target=5e4；最大注入时间：35 ms；碰撞能量：32；

原始数据通过Spectronaut X合并分析搜库，数据库使用Uniprot或提供的数据库，另外同时搜索污染序列库，以判断样本是否存在污染，设置胰蛋白酶酶解；搜库参数：固定修饰：脲甲基化，可变修饰：蛋氨酸氧化；母离子和肽段水平的假阳性率FDR都设置为1%；

各样品加入30μL 溶液丙制成悬浮液，取出9 μL加入1 μL 10×iRT肽段，混合后用纳米液相色谱分离，经在线电喷雾串联质谱分析；整套实验系统为串联EASY-nLC 1200系统的轨道阱质谱仪；总共上样3 μL，以120 min梯度分离：5%溶液丁至35%溶液丁；柱流量控制在200nL/min，电喷雾电压2 kV；

质谱参数设置如下：(1) MS: 扫描范围m/z：350–1500；分辨率：120,000; AGC target：4e6; 最大注入时间：50 ms；(2) HCD-MS/MS：分辨率：30,000；AGC target：1e6；碰撞能量：32；能量增加：5%；(3)可变窗口采集，设置了60个窗口，设置重叠窗口，每个窗口重叠1m/z；

步骤D、蛋白质定性定量分析

采用QuiC软件对原始质谱数据进行质控后，运用Pulsar软件对DDA采集模式得到的数据进行建库，建库鉴定标准为：前体阈值1.0% FDR，蛋白质阈值1.0% FDR，用于后续DIA数据的定性分析；

步骤E、差异表达蛋白质筛选

以相对定量值差异倍数的绝对值＞2.0倍，并且Student′s t-test qvalue（检测Q值）0.05筛选差异表达蛋白质；

所述的步骤A中，睾丸组织来自性成熟前和性成熟后2个关键发育时期具有相似遗传背景的雄性藏绵羊；

所述的步骤B中，所述的裂解液，由以下成分组成：7M尿素，2% SDS，0.1%PMSF和65mMDTT;

所述的步骤C中，所述的缓冲液甲，由以下成分组成：20mM甲酸铵水溶液，pH=10.0；

所述的步骤C中，所述的溶液乙，由以下成分组成：80% ACN 中加入20mM 甲酸铵，氨水调节至pH 10.0；

所述的步骤C中，所述的溶液丙为0.1%甲酸水溶液；

所述的步骤C中，所述的溶液丁为0.1%甲酸乙腈溶液。