[发明专利]基于DIA技术挖掘性成熟前后藏绵羊睾丸差异蛋白质的方法

说明书

本发明公开了一种基于DIA技术挖掘性成熟前后藏绵羊睾丸差异蛋白质的方法，包括以下步骤：组织收集、蛋白样本制备、建立谱图数据库、蛋白质定性定量分析和差异表达蛋白质筛选。本发明选取3月龄和1岁龄藏绵羊睾丸组织，运用常规DDA质谱检测技术分析并建立图谱数据库，随后采用DIA方法进行质谱数据采集，并对样品中的蛋白质进行定性定量分析，从而获得藏绵羊睾丸中的差异表达蛋白质。利用该方法可实现对藏绵羊睾丸差异表达蛋白的定量筛选，这对于后续从蛋白质组学角度研究在高海拔条件下藏绵羊睾丸发育或精子发生的分子机制提供了十分重要的理论基础。

技术领域

本发明涉及DIA定量方法技术领域，尤其涉及一种基于DIA技术挖掘性成熟前后藏绵羊睾丸差异蛋白质的方法。

背景技术

藏绵羊作为中国3大原始绵羊品种之一，主要分布于海拔3000m以上青藏高原的西藏、青海以及甘肃、四川等地，是产区农牧民重要的生产和生活资料，对带动当地的经济社会可持续发展和维持生态平衡具有十分重要的作用。但由于长期放牧且缺乏补饲，导致其生产性能低、繁殖力低下、性成熟晚，严重限制了藏绵羊群的繁殖，进而制约了牧区的经济社会发展。蛋白质是有机体生命活动过程中的主要参与者和执行者。因而探究不同发育期藏绵羊睾丸组织蛋白质组学，进而筛选各个时期的特异表达蛋白或极显著差异表达蛋白，对于揭示藏绵羊睾丸发育的分子机制具有十分重要的意义，也可为后续的分子辅助育种提供理论依据。

近些年，生物学、精准医学越来越多的需要蛋白质组学数据，其大样品量对蛋白质组方法的重现性和通量提出了越来越高的要求。常规的数据依赖采集模式下，母离子采集的随机性会造成肽段鉴定的重现性差。因此，近年来，数据非依赖(DIA)的采集模式已经得到了广泛的关注。它的主要优势在于可以实现信息的无损采集，且数据之间具有很高的重现性。

本发明涉及一种基于重复性更好、通量更高、定量更为准确的DIA蛋白定量技术全面扫描并筛选不同发育期藏绵羊睾丸差异表达蛋白质的方法。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种基于DIA技术挖掘性成熟前后藏绵羊睾丸差异蛋白质的方法。

本发明的技术方案如下：

一种基于DIA技术挖掘性成熟前后藏绵羊睾丸差异蛋白质的方法，包括以下步骤：

步骤A、组织收集

羊屠宰后，取出睾丸组织，用PBS清洗外部血渍并剥除白膜后，将其剪成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小组织快，迅速冻存于液氮中用于蛋白样本的制备；

步骤B、蛋白样本制备

向睾丸组织中加入裂解液，超声裂解；4℃，14000rpm条件下离心25-35min后，吸取上清液，用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度；取50μg蛋白质稀释至50μL，随后加入1M DTT 1μL，在55℃孵育50-75min；加入1M碘乙酰胺(IAA)5μL，室温避光50-75min；加入300μL预冷的丙酮沉淀105-140min，沉淀用胰蛋白酶酶解过夜；

步骤C、建立谱图数据库

将所有酶解后的肽段混合物溶解于缓冲液甲(20mM甲酸铵水溶液，pH＝10.0)中，用Ultimate 3000系统连接反向柱进行高pH反向分离，分离使用线性梯度，40min内5％溶液乙至45％溶液乙；柱子在初始条件下平衡15min，柱流速维持在1mL/min，柱温维持在30℃；收集到6个部分，各个部分在真空浓缩仪中干燥；将除盐冻干后的肽段重溶于溶液丙中，后经由配备在线纳喷离子源的LC-MS/MS分析；整套系统为串联EASY-nLC 1200系统的轨道阱质谱仪；总共上样3μL，以120min梯度分离：5％溶液丁至35％溶液丁；柱流量控制在200nL/min，电喷雾电压2kV；