[发明专利]基于发夹式结构的核酸恒温扩增方法及其试剂盒应用

权利要求书

1.基于发夹式结构核酸恒温扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)引物设计：设计一对内扩增引物，一条环引物，一条人工引物以及两条剥离引物；

2)扩增过程：在扩增靶核酸序列时，内扩增引物/内扩增引物、内扩增引物/环引物和内扩增引物/人工引物之间能在具有链置换功能的DNA聚合酶的作用下生成不同类型的扩增产物，这些扩增产物由于分子内的自我杂交重组进而形成不对称的发夹式DNA二级结构；由这些具有不对称发夹式DNA二级结构的扩增产物可以作为后续扩增反应的模板，并在具有链置换功能的DNA聚合酶和内扩增引物/外人工引物/环引物的作用下以线性结构或二级结构的方式进行扩增，从而达到对靶核酸序列进行扩增的目的。

2.如权利要求1所述的基于发夹式结构核酸恒温扩增方法，其特征在于，还包括如下步骤：

3)扩增产物检测：通过在反应中加入染料或者探针，随着反应的进行，反应中的靶向基因浓度不断升高，导致溶液中的荧光信号逐渐发生变化或者导致溶液的颜色发生变化。

3.根据权利要求1或2所述的基于发夹式结构核酸恒温扩增方法，其特征在于，所述的引物设计包括如下过程：

a)内扩增引物的设计：设计一对内扩增引物，内扩增引物是指参与基于发夹式结构基于发夹式结构的核酸恒温扩增反应的主要的单链寡核苷酸序列之一；正向内扩增引物的3’末端的扩增延伸序列与靶向核酸反义链完全互补，而其5’末端的杂交末端序列为一个具有发夹式结构的DNA序列；反向内扩增引物的3’的扩增延伸末端序列与靶向核酸正义链完全互补，而其5’末端为正向内扩增引物的3’末端序列；

b)人工引物的设计：人工引物与正向内扩增引物的5’末端的序列完全一致，但是该引物无任何的发夹式结构；

c)环引物的设计：设计环引物，环引物是指参与基于发夹式结构基于发夹式结构的核酸恒温扩增反应的主要的单链寡核苷酸序列之一；环引物与靶向核酸反义链完全互补，它位于内扩增引物扩增的片段之内；

d)剥离引物的设计，分别包括正向剥离引物，反向剥离引物；正向剥离引物和反向剥离引物分别与靶基因的反义链和正义链完全互补。

4.根据权利要求3所述的基于发夹式结构核酸恒温扩增方法，其特征在于：所述的扩增过程包括以下步骤：

a)正向内扩增引物和环引物分别与靶核酸分子的反义链杂交；然后在具备链置换功能的DNA聚合酶作用下进行延伸；

b)正向剥离引物与靶核酸分子反义链杂交；然后在具备链置换功能的DNA聚合酶作用下进行延伸；从而剥离出两条分别由正向内扩增引物和环引物引物延伸所产生的单链产物；

c)所剥离的两条分别由正向内扩增引物和环引物延伸所产生的单链产物可作为反向内扩增引物杂交/延伸的模板；

d)反向剥离引物可分别与两条由正向内扩增引物和正向外扩增引物延伸所产生的单链产物进行杂交，然后在具备链置换功能的DNA聚合酶作用下进行延伸；该延伸过程将产生由正向内扩增引物和反向内扩增引物完全互补的单链DNA序列；

e)包含正向内扩增引物和反向内扩增引物完全互补序列的单链DNA由于其序列中存在互补序列，因此可以在分子热力学的作用下，进而可以在其两端形成两个不对称的发夹式DNA二级结构；

f)所形成的不对称的发夹式二级结构可以作为扩增的模板，通过与人工引物，内扩增引物和环引物进行反复的杂交和延伸；所形成的产物可以形成更多的能形成二级结构的单链或者双链产物；所形成的这些产物又可作为扩增的模板参与下一阶段的扩增，从而能达到快速扩增靶序列的目的。

5.根据权利要求1或2或4中任一项所述的基于发夹式结构核酸恒温扩增方法，其特征在于：所述的二级结构能在分子热力学的作用下发生自身的折叠，进而在一条单链上形成不对称的发夹式结构。

6.根据权利要求1或2或4中任一项所述的基于发夹式结构核酸恒温扩增方法，其特征在于：所述的二级结构能在分子热力学的作用下发生自身的折叠，进而形成在一条长链出现多个发夹式结构。