[发明专利]基于发夹式结构的核酸恒温扩增方法及其试剂盒应用

说明书

本发明是涉及设计相关特异性引物，使得的其在恒温条件下对靶核酸序列进行扩增时形成特殊用途的发夹式结构，并通过发夹式结构结构介导后续的指数式的扩增，从而达到对靶标分子实现高效高灵敏检测的目的。同时，本发明还涉及了其在快速核酸诊断方面有关试剂盒的应用，包括其在细菌和病毒等病原微生物检测方面的应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中核酸分子生物学检测方法，具体的涉及基于发夹式结构基于发夹式结构的核酸恒温扩增方法及其试剂盒应用。

背景技术

对全球的流行病趋势调查研究表明，常规的病原菌检测手段，如细菌培养、形态学检测和生化鉴定等，由于其灵敏度低、特异性差、步骤繁琐和对仪器设备的依赖等不足，已经无法有效的满足致病微生物进行快速和特异性现场检测的要求。分子生物学技术，特别是核酸扩增技术的快速发展，极大的提高病原菌的检测水平，因此对传染病的传播和治疗起到了良好的控制和预防效果。同时，由于核酸扩增技术可以直接在不需要对病原微生物进行分离培养的基础上直接用于临床标本的检测，并能在较短时间内(2-3小时)得出结果，因此在感染性疾病的诊断中得到了越来越广泛的应用。这些分子检测技术与其他分子生物学技术以及生物信息学手段结合，正向快速朝着准确、快速、灵敏以及自动化的方向发展。

目前，根据扩增过程中对温度的变化过程要求，核酸扩增检测技术大致可以分为两类：

1.依赖于温度循环往复变化：主要以聚合酶链反应(PCR)和连接酶链式反应(1igase chain reaction，LCR)为主。PCR/LCR反应的每一个循环过程中都包括靶标双链分子的变性解链，引物与靶标单链分子的杂交复性过程和在相应的酶促反应下进行引物的延伸/连接反应。同时，每次循环新合成的双链DNA片段又可成为下次循环的模板，这就可以使靶序列DNA数量能以指数扩增的方式增加，从而达到快速富集靶标分子的目的。PCR技术是目前最成熟的核酸扩增技术，并已经得到了极为广泛的应用和发展。但是，PCR技术需要专门的仪器以支持温度的循环往复变化，同时为了解决扩增产物污染和达到实时检测的目的往往需要与相应的荧光检测系统配套，但是这增加了成本和提高了实验操作人员的要求。这些缺点限制了其在现场检测事件和基层社区医院的推广和应用。

2.核酸恒温扩增系统：该系统是指核酸扩增过程中的核酸靶标分子与引物之间的变性、复性和延伸可在一个恒定温度的条件下进行，并不需要通过升温降温的物理过程过程来实现。目前比较常见的技术如链置换扩增技术(strand displacementamplification，SDA)，核酸序列扩增技术(Nucleic Acid Sequence BasedAmplification,NASBA)，转录酶扩增技术(Transcription Mediated Amplification,TMA)，滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification,RCA)，连环恒温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，解链酶扩增技术(Helicase DependentAmplification,HDA)，和交叉引物扩增技术(Cross Priming Amplification,CPA)等。相对PCR技术而言，这些核酸恒温扩增技术不仅具有高特异性和高灵敏度的特点，同时还具有操作简单，对仪器设备的要求低往往一台水浴锅甚至简易的保温杯即能有效实现扩增反应的优势。核酸恒温扩增技术还可以与不同的检测技术结合，可直接通过肉眼对相关的扩增产物进行快速有效的检测和判断，并不需要借助于特殊的仪器和设备，如通过在反应中加入一定量的钙黄绿素，可以通过肉眼通过观察反应页是否发生颜色的变化从而判断LAMP是否进行。这些核酸恒温扩增系统由于其简便快捷，因此适合现场检测以及在基层医疗单位的推广使用。