[发明专利]用于菠菜器官与非生物胁迫应答研究的内参基因及应用

说明书

本发明属于植物分子生物学领域，尤其涉及一组用于菠菜器官与非生物胁迫应答研究的内参基因及应用。在不同器官中的所述内参基因为18s rRNA和ARF，在高温胁迫下的所述内参基因为Actin和ARF，在重金属镉胁迫下的所述内参基因为ARF和EF1α，在盐NaCl胁迫下的所述内参基因为COX和18s rRNA，在NaHCO₃胁迫下的所述内参基因为RPL和Actin，以及在Na₂CO₃胁迫下的所述内参基因为ARF和CYP。本发明还提供了内参基因18s rRNA、Actin、ARF、COX、CYP、EF1α和RPL的特异性的正向引物和反向引物，并用bZIP9和HSFB2b基因在高温胁迫下的表达模式验证了本发明的可靠性。

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，尤其涉及一种适用于菠菜器官与非生物胁迫应答研究的内参基因、其特异性引物及应用。

背景技术

菠菜(Spinacia oleracea)又名赤根菜、波斯菜等，是石竹目苋科菠菜属一年 生草本植物。菠菜富含类葫萝卜素、维生素C、钙和铁等营养元素，是一种倍受人 们喜爱的绿色蔬菜。菠菜原产于亚洲中部和西南部，所以大多数菠菜品种都具有耐 寒性，但对高温敏感。我国南方夏季高温影响菠菜的生长发育，导致菠菜产量和品 质显著下降，其他一些非生物胁迫也同样影响着菠菜的生产。研究菠菜基因功能， 尤其是参与胁迫响应的基因功能已经成为了一个重要议题。而在研究基因功能时， 我们又需要检测目的基因在不同条件下的表达模式。

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)出现于1992年，是一种准确、简便的基因表 达水平检测方法。在根据2^-△△Ct方法计算目的基因表达量时，选择合适的内参基因 是通过RT-qPCR检测基因表达水平的关键，使用不正确的内参基因将会导致检测 结果不可靠。RT-qPCR中常用的内参基因通常是看家基因，它们通常具有稳定的 mRNA水平。人们常以18S核糖体RNA(18S rRNA)、肌动蛋白(Actin)和甘油 醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等作为内参基因，但它们不适用于所有条件。因此， 在RT-qPCR实验中，选择合适的内参基因是非常必要的。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了一组适用于菠菜器官及非生物胁迫应答研究的内参基因、特异性引物及其在RT-qPCR中的应用，为研究不同条件下基因表 达量的变化提供依据。

为此，本发明使用RT-qPCR技术分析了10个候选基因在不同器官(根、茎、 叶、雌花、雄花、苗)以及在5种逆境条件(高温：37℃，重金属胁迫：200μmol/L CdCl₂，盐胁迫：200mmol/L NaCl，碱胁迫：200mmol/L NaHCO₃和100mmol/L Na₂CO₃)下根部和叶片中的表达水平，并以NormFinder和BestKeeper软件分 析不同条件下10个候选基因表达量的稳定性。

优选地，不同器官中最适的内参基因为18s rRNA和ARF，高温胁迫下最 适的内参基因为Actin和ARF，重金属(镉)胁迫下最适的内参基因为ARF和 EF1α，盐胁迫(NaCl)下最适的内参基因为COX和18s rRNA，NaHCO₃胁迫 下最适的内参基因为RPL和Actin，Na₂CO₃胁迫下最适的内参基因为ARF和 CYP。利用表达量最稳定的Actin、ARF，以及表达量相对不稳定的TUBα对bZIP9 和HSFB2b这2个高温响应基因在37℃条件下的表达模式进行标准化，证明本 发明的可靠性和实用性。