[发明专利]一种用于蓝舌病病毒8型检测的试剂、检测方法及应用

说明书

本申请公开了一种用于蓝舌病病毒8型检测的试剂、检测方法及应用。本申请试剂，包括特异性引物对和探针，引物对上下游引物分别为Seq ID No.1和2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列；SEQ ID No.3所示序列中，第32碱基修饰荧光淬灭基团‑dT，第33碱基替换为碱基类似物，第35碱基修饰荧光基团‑dT，3’末端修饰C3Spacer。本申请试剂，能通过一步法逆转录重组酶聚合酶扩增对蓝舌病病毒8型进行灵敏、特异、高效检测。采用本申请试剂可方便的对蓝舌病病毒8型进行现场检测，快速获得检测结果；对于蓝舌病病毒8型快速防控，防止疫情传播，最大限度保障生产安全具有重大意义。

技术领域

本申请涉及蓝舌病病毒8型检测领域，特别是涉及一种用于蓝舌病病毒8型检测的试剂、检测方法及应用。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue,BT)是一种传染性、非接触性、通过库蠓等虫媒传播的病毒性疾病，该病的病原为蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)，属于呼肠弧病毒科环状病毒属。BT主要影响野生和家养的绵羊、山羊、牛、水牛、鹿、大多数非洲羚羊等反刍动物。染疫动物的平均病死率为30％，其中绵羊的病死率可高达80％。BT严重影响着许多国家的畜牧业和国际贸易的发展，世界卫生组织将其列为须呈报的动物疫病，中国将其列为一类动物疫病。BTV血清型众多，目前OIE已确认有26个血清型，不同血清型病毒之间缺乏交叉免疫保护，给疫病的防控带来了极大挑战。2006年，蓝舌病病毒8型(BTV-8)在荷兰首次被发现，除了绵羊和山羊，牛感染BTV-8后也引起了严重的疾病，BTV-8随后在欧洲出现大规模流行，造成了严重的经济损失，目前暂未见BTV-8在中国的报道。中国主要流行12种血清型蓝舌病病毒，包括BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-9、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-21和BTV-24。

BTV基因组由十个双链RNA(dsRNA)片段组成，它们编码11种不同的病毒蛋白，包括7种结构蛋白(VP1-VP7)和4种非结构蛋白(NS1-NS4)。BTV颗粒由三个蛋白质层组成，外衣壳层包含VP2和VP5两种蛋白，其中基因组片段2(Seg-2)编码的VP2是主要的中和抗原和血清型特异性的主要决定因素；去除外层VP2/VP5后留下双层二十面体核心粒子，该双层核心粒子外层完全由VP7壳粒组成，完整的内衣壳(亚核层)，包围10个双链RNA基因组区段和次要结构蛋白。不同血清型的基因组片段2(segment 2)长度不同，约3000bp左右，该片段编码外壳蛋白VP2，该蛋白氨基酸序列差异从22.4％到73％不等，表明VP2基因序列可用于血清型的鉴定。

传统的蓝舌病病毒鉴定需要在鸡胚、库蠓细胞、敏感反刍动物的组织培养或接种中分离和扩增病毒，然后进行血清组和血清型特异性试验。然而，上述方法成本高、耗时长，并且需要获得参考病毒或抗血清。近年来实时荧光PCR在动物疫病诊断检测方面应用广泛，与传统血清学方法相比，该方法快速、可靠，已成为许多实验室的标准诊断检测方法。目前已经有部分关于BTV种或血清组特异性PCR检测的相关研究和报道；但是，这些检测都需要借助特殊的仪器设备，并且检测流程相对复杂，难以适用于现场检测。BTV-8是一种外来病，虽然中国暂未见发现该病的报道，但随着中国进口动物及动物产品贸易量的不断增长，BTV-8存在传入中国的风险，一旦传入将会给我国的养殖业造成巨大影响，因此亟需建立一种能够更好的适用于现场快速检测的BTV-8检测方法，以防止BTV-8传入或扩散。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于蓝舌病病毒8型检测的试剂、检测方法及应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于蓝舌病病毒8型检测的试剂，该试剂包括用于一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的蓝舌病病毒8型特异性引物对和探针，探针在引物对的扩增靶标区域内，引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列；