[发明专利]一种假诺卡氏菌株的遗传转化方法及其应用

说明书

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种假诺卡氏菌株(Pseudonocardia sp.WBY129428)的遗传转化方法及其应用。本发明首先将pSET152质粒转化到ETU(pUZ8002)大肠杆菌菌株中，然后通过细菌接合作用将pSET152质粒转移到假诺卡氏菌的孢子内。本发明的目的在于将外源DNA通过接合转移的方式导入到假诺卡氏菌菌株，并提供完善的假诺卡氏菌菌株遗传操作体系。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种假诺卡氏菌株的遗传转化方法及其应用。

背景技术

放线菌是一类(G+C)含量高的生防菌，广泛分布于自然界中，具有复杂的次级代谢系统，能产生诸多结构新颖、生物活性显著的代谢产物，是新医药和新农药研制的源头，在植物病害生防中具有重要意义。目前发现的上万种天然抗生素中，约70％是由放线菌产生的。

假诺卡氏菌科是一类进化上相近，形态各异，胞壁肽聚糖含有Meso-DAP(内消旋二氨基庚二酸)，细胞水解液中含有半乳糖和阿拉伯糖，不含枝菌酸的放线菌。该科中极少有病原菌，是一类安全的微生物。该科的许多成员都能产生重要的生物活性物质，包括抗生素酶类维生素等。但目前关于该科的报道较少，其遗传转化体系尚不成熟，阻碍了对于该菌的理论及实际研究。目前为止还没有关于假诺卡氏菌的遗传转化方法的报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种假诺卡氏菌株的遗传转化方法及其应用。本技术的目的在于将外源DNA通过接合转移的方式导入到本技术所用到的假诺卡氏菌菌株，提供完善的假诺卡氏菌菌株遗传操作体系。

本发明是这样实现的，一种假诺卡氏菌株的遗传转化方法，包括以下步骤：

步骤1：将假诺卡氏菌置于CP培养基培养，获取孢子；

步骤2：将pSET152质粒转化至感受态细胞，并置于含抗生素的LB培养基培养；

步骤3：将步骤1获得的假诺卡氏菌孢子与步骤2获得的转化后携带有目的质粒的ET12567/pUZ8002大肠杆菌细胞混合，并置于ISP4固体培养基培养；其中Pseudonocardiasp.WBY129428菌的孢子和携带有目的质粒的ET12567/pUZ8002大肠杆菌细胞的数量均为4*10⁷；

步骤4：将阿泊拉霉素和萘啶酮酸覆盖步骤3中的ISP4固体平板，继续培养。

进一步，步骤1中，将假诺卡氏菌置于固体CP培养基30℃培养4天，可在平板表面获取孢子。

进一步，步骤2中所述感受态细胞为ET12567/pUZ8002感受态细胞，所述ET12567/pUZ8002感受态细胞在浓度均为25ug/mL的卡那霉素和氯霉素存在的条件下制备。

进一步，步骤2中所述抗生素为卡那霉素，氯霉素和阿泊拉霉素的混合物。

进一步，步骤2中将转化后的感受态细胞培养至OD₆₀₀达到0.4-0.6。

进一步，步骤3中在ISP4固体培养基培养12-13小时。

进一步，步骤4中将阿泊拉霉素和萘啶酮酸覆盖ISP4固体平板，晾干40min，30℃培养箱培养6天。

进一步，步骤2中将外源DNA片段构建至pSET152质粒中后，再进行后续遗传转化实验。

进一步，所述外源DNA片段包括启动子片段。

如权利要求1-9任一所述的一种假诺卡氏菌株的遗传转化方法在将外源DNA片段导入假诺卡氏菌株中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：