[发明专利]一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物、探针及其试剂盒

说明书

本发明涉及一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物和探针及其试剂盒。本方法利用数字PCR检测平台，在一个PCR扩增体系中加入试剂盒中核苷酸序列如SEQ ID No：1～7所示的引物和探针，并将BCR‑ABL1融合基因与自对照同时扩增，即以待检基因自身作为对照，显著减少多引物多扩增所带来的信号干扰，无需标准品即可实现转录本拷贝数检测，在检测灵敏度达到0.001％的同时，检测的精密度提高了3倍以上。

技术领域

本发明属于医学核酸检测技术领域，具体涉及一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物、探针及其试剂盒。

背景技术

微小残留(Minimal Residual Disease，MRD)白血病是指白血病患者按目前的疗效标准经过治疗取得完全缓解(Complete Remission，CR)后体内残存微量白血病细胞的状态。随着医学水平的发展以及各种新药的出现，白血病的完全缓解率得到了很大改善，但仍有相当一部分病人在CR后出现复发，生存期缩短，最终导致死亡。其中最主要的原因是骨髓中MRD的持续存在。据研究表明，若MRD的数量在治疗后第12周还在10^-4以上时，急性白血病复发的可能性就非常大，就必须进行缓解后的巩固及强化治疗来降低临床复发风险及复发率。因此，MRD可作为预后评价的敏感指标，MRD如果小于10^-4，复发可能性小，大于10^-4则提示疾病复发可能性极大，且MRD值越小无复发生存期则越长。目前，临床判断白血病患者是否复发的主要指标可分为两类：一是临床症状，如患者年龄、性别、白细胞数、中枢神经系统白血病的发生、首次完全缓解所需时间，但是骨髓细胞形态学检查敏感度低，难以准确反映CR时患者体内残留的白血病细胞数；二是白血病细胞的生物学特性，如细胞的遗传学、免疫学等，这两类指标虽对预后复发判断有很大的帮助，但均属间接分析。MRD的诊断必须依赖敏感度更高、特异性更强的特殊检测手段。经典的MRD检测手段包括流式细胞术(FCM)、染色体核型分析、FISH检测和实时荧光定量PCR检测。同时，由于每个患者白血病细胞的特异标志不完全相同，并且白血病细胞上还带有很多正常细胞的标志，从而容易逃脱机体的免疫监视。因此，怎样确定白血病细胞特有的免疫特征，检出混杂在正常造血细胞中的微量白血病细胞，并建立一种检测灵敏度高、并可实时监控微小残留含量变化的试剂盒对早期预测白血病复发及延长白血病患者的无病生存期并依据检测结果为患者提出治疗方案具有重大的社会意义。

白血病与相关基因变异的关系，以其中常见的慢性粒细胞白血病(CML)检测为例，95％CML的病例皆因BCR-ABL基因产生融合后翻译出新的蛋白质而导致细胞的恶性转化，同时也因为BCR-ABL基因水平检测简单准确、意义明确而被采用作为MRD的检测指标，此外该检测仅需进行血液检测，无需骨髓活检。国际临床试验结论以及CML治疗指南的制定也均来自于BCR-ABL IS数据，BCR-ABL融合基因检测对于前期CML疾病辅助诊断及后续靶向用药指导及残留病监测方面亦具有重要的临床意义。目前临床上检查BCR-ABL融合基因的金标准是荧光定量PCR技术，按照目前的实践指南，患者每三个月要进行一次检测，结果以％IS单位报告，但一是由于qPCR技术的定量检测依赖标准的参考物质；二是由于qPCR技术的局限性导致检测灵敏度不够高，使RT-PCR在LoD和LoQ方面具有局限性，使其检测灵敏度一般为0.01％IS(MR4.0)，即在10000个正常细胞中可以检出1个白血病细胞，而MRD有效的监测和治疗检测灵敏度需要达到0.002％IS(MR4.7)以下。因此，RT-PCR所具备的0.01％IS(MR4.0)的检测灵敏度就会影响对CML患者临床治疗方案的制定，如果可以更早在正常细胞中检测出白血病细胞，即找到比qPCR灵敏度更高的检测方法，即达到0.001％IS(MR5.0)甚至更低的MRD检测技术，那么就会更早发现白血病复发的状况，为患者更早提供治疗方案，大大延长患者的生存期，但是目前针对这种0.001％IS(MR5.0)以及更低检测灵敏度并且检测重复性好的MRD检测技术在国内还处于空白状态。

发明内容