[发明专利]一种枪头式分散固相微萃取柱、基于该枪头式分散固相微萃取柱的纯化方法及应用

说明书

本发明涉及一种枪头式分散固相微萃取柱、基于该枪头式分散固相微萃取柱的纯化方法及应用，通过将松散的湿性填料与特制枪头式分散移液管相结合，构成枪头式分散固相微萃取柱，通过从枪头式分散固相微萃取柱底端吸入的方式，达到纯化目标抗体的目的。当吸入液体时，松散的湿性填料随溶液湍流与样品快速混合，利用涡旋混合保证填料与样品具有更大的接触表面积，使得相对于其他亲和纯化柱具有更快的速度，更便捷的操作，并且可高效的去除样品中其他杂质，节省样品制备时间的同时能有效的减少溶剂的用量。同时可配套使用Hamilton、Integra等自动移液系统，实现在短时间内同时纯化多个样品。

技术领域

本发明涉及固相萃取分离装置，以及利用该固相萃取分离装置对CHO细胞培养上清液中单克隆抗体的纯化方法。

背景技术

抗体是指能与相应抗原特异结合的具有免疫活性的球蛋白，由两条重链和两条轻链组成，分为可变区(V)和恒定区(C)，在人体免疫系统中发挥着极其重要的作用。目前抗体已广泛应用在医药健康、环境监测及食品安全等领域，其中单克隆抗体以其特异性高、专一性强、亲和力不变等优点，不仅广泛应用于遗传学、肿瘤学、微生物学、细胞生物学等科学研究领域且为人类疾病的诊断、新型疫苗的制备、体内肿瘤定位、靶向药物的研制、防止移植物的排异反应等提供了较为理想的手段。尤其对肿瘤的免疫治疗法而言，单克隆抗体药已经成为行业的引擎，而抗体类药物的研发生产主要包括靶点及单抗的发现筛选、临床前研究、临床试验和商业化生产等阶段。

对新型的抗体的筛选及研发而言，快速可靠的分离提纯技术是整个技术的关键。例如，以噬菌体抗体库、转基因小鼠为代表的全人源筛选技术是目前全人源抗体筛选的最主要手段，研究人员常常需要筛选上万个或更多抗体库，才可能获得对靶标分子(或细胞)有专属选择性的候选抗体，而如何能够提高筛选速度及准确度是提高抗体药开发效率的关键。

单克隆抗体的制备较为复杂，其中涉及多种生物学技术。通过不同方法制备的抗体往往与多种杂蛋白混杂在一起，为了获得成分相对单一的抗体或将抗体用于特定的用途，就需要进行抗体纯化。在制备特异性抗体过程中当抗体的效价达到实验预期之后，所制备抗体的纯度关键取决于所选择的纯化方法。抗体纯化方法的选择一般取决于抗体的来源、时间的需求、成本的预算以及抗体的最终用途等。目前抗体纯化的最常用手段是亲和纯化法，但该方法的常规是个耗时的过程，涉及长时间的孵育步骤和多个洗涤步骤，需经过多次移液和离心。典型的旋转柱亲和提取方法需要一个小时来结合抗体，并且需要大量的缓冲溶液以通过多个离心步骤洗掉非特异性结合蛋白。另外，由于技术所限，国内及国际大多数生物药企业在初期筛选过程中还是使用商用纯化试剂盒，利用重力柱法(包括FPLC联用分离柱)、磁珠法(Magnetic Beads)或离心萃取法(Spin Column)手动提纯抗体，效率极低。Protein A/G包被的96孔微孔板有时也被用于抗体的初期筛选，尽管可以进行高通量筛选，但其抗体提纯容量偏低，且数据平行性(reproducibility)差，所以不适合抗体的提纯及平行筛选。尽管有些技术试图将其抗体的亲和分析柱和各种自动化的移液操作平台相结合，但是还是无法解决在高通量抗体分离时容量小、回收率低、及平行性差等缺陷，无法真正推广应用在实际研发过程中。

在生物医疗诊断行业高速发展的现今，药用及检测用抗体的市场需求量显著增加，提供一种高效快速的抗体纯化方法尤为重要，与此相关，针对抗体药的系统化的药效、毒理及PK、PD测试、生产工艺的开发及优化、以及中试及GMP生产过程中的QA、QC等各个环节，快速、可靠、高通量的自动化分离分析技术都将极大地提高效率，降低时间、人员成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用枪头式悬浮固相萃取技术(Dispersive SolidPhase Extraction,DSPE)进行抗体纯化的高通量方法，该方法通过将松散的湿性填料与特制枪头式分散移液管相结合，构成枪头式分散固相微萃取柱，通过从枪头式分散固相微萃取柱底端吸入的方式，达到快速纯化目标抗体的目的。