[发明专利]一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法

权利要求书

1.一种食用菌单倍体的无菌快速分离方法，其特征在于：包括以下具体步骤：

第一步，将菌丝置于液体培养基中于25℃培养3～8天，无菌过滤得成熟的菌丝体；

第二步，取第一步得到的菌丝体于无菌离心管内，加入研磨珠研磨30～120s；将研磨后的菌丝体进行处理得到染色菌丝液或染色原生质体悬浮液；其中，将菌丝体处理得到染色菌丝液的具体方法为：向三角瓶内加入裂解液，将研磨后的菌丝转移至三角瓶内裂解20～40min，过滤，滤液内加入DAPI染色剂染色10～20min，得到染色菌丝液；

将菌丝体处理得到染色原生质体悬浮液的具体方法为：三角瓶内加入酶解液，将研磨后的菌丝体转移至三角瓶内，酶解3～5h，过滤，依次用KCl溶液、STC溶液洗涤，再用STC溶液悬浮得到原生质体悬浮液，向原生质体悬浮液中加入DAPI染色剂染色10～20min得染色原生质体悬浮液；其中，所述酶解液为溶壁酶溶液，具体配制方法为：称取0.3g溶壁酶溶解在3mL N-buffer中，待溶壁酶完全溶解后用微孔过滤膜过滤除菌，向滤液中添加17mL P-buffer制得浓度为1.5%的酶解液；

P-buffer为0.6M缓冲渗稳剂，其配制方法包括以下内容：称取39.35g MgSO₄ 、1.76g柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解后转移至200mL容量瓶内定容，定容后调节pH至5.5；

N-buffer的配制方法包括以下内容：称取9.11g山梨醇、0.74g柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解后转移至50mL容量瓶内定容，定容后调节pH至5.8；

第三步，将第二步得到的染色菌丝液或染色原生质体悬浮液用流式细胞仪进行倍性分析，找到有效的峰值区域，确定菌丝单倍体或原生质体单倍体的区域间阈值的M值，菌丝二倍体或原生质体二倍体的区域间阈值的M值，菌丝单倍体M值和菌丝二倍体M值的倍数关系或原生质体单倍体M值与原生质体二倍体M值的倍数关系；

第四步，按照第三步中确定的菌丝单倍体M值和菌丝二倍体M值调整流式细胞仪的分选参数，利用流式细胞仪对第二步中的染色菌丝液进行分选，收集得到菌丝单倍体；

或者按照第三步中确定的原生质体单倍体M值和原生质体二倍体M值调整流式细胞仪的分选参数，利用流式细胞仪对第二步中的染色原生质体悬浮液进行分选，收集得到原生质体单倍体。

2.根据权利要求1所述食用菌单倍体的无菌快速分离方法，其特征在于：所述第二步菌丝体的重量与酶解液的体积比为1:5～1:10。

3.根据权利要求1所述的食用菌单倍体的无菌快速分离方法，其特征在于：所述第二步中菌丝体的酶解温度为30～37℃。